Сотовый агрегации анализов для оценки привязки дрозофилы паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандами

Общей целью данного агрегационного анализа является оценка связывания рецептора Notch с транс-лигандами и его ингибирования цис-лигандами. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос: как генетический или фармакологический фактор повлияет на связывание рецептора Notch с его лигандом и изменит передачу сигналов? Основное преимущество данной методики заключается в том, что она позволяет оценить транс- и цис-связывание рецептора Notch с его лигандом.

Интересно, что без задействования перекрывающего эффекта эндогенный лиганд. Начните оценку с замедления сигнальных клеток и их ресуспендирования в среде Шнайдера. Подсчитайте клетки вручную с помощью гемацитометра.

Пластину пять раз по 10 до пятой части S2 и стабильные S2-Notch ячейки в каждой лунке шестилуночного планшета, по одному миллилитру на лунку Schneider's Medium. Затем добавьте 7,5 микрограммов двухцепочечной РНК в каждую лунку и инкубируйте клетки при температуре 25 градусов Цельсия в течение 24 часов. Добавьте 0,7 миллимоляра сульфата меди, чтобы вызвать экспрессию Notch, и инкубируйте клетки при температуре 25 градусов Цельсия в течение трех дней.

После инкубации подсчитайте количество клеток, передающих сигнал, вручную с помощью гемацитометра. И пластину пять раз по 10 до шестой стабильных клеток в каждой лунке шестилуночного планшета, по одному миллилитру на лунку дополненной среды Шнайдера. Затем добавьте 0,7 миллимоляра сульфата меди, чтобы индуцировать экспрессию лигандов, и инкубируйте клетки при температуре 25 градусов Цельсия в течение трех часов.

Соберите двухцепочечные РНК-обработанные клетки S2-контроля и S2-Notch, обработанные с помощью щадящего пипетирования. И планшет 2,5 умножить на 10 до пятой ячейки на лунку в 24-луночном планшете. Добавьте пять раз по 10 к пятой стабильной S2-Delta или S2-Пильчатой Томатной клетке до общего объема 200 микролитров дополненной Schneider's Medium.

Поместите пластину на орбитальный шейкер со скоростью вращения 150 об/мин. Через минуту перемешайте содержимое каждой лунки, и выньте по 20 микролитров, чтобы подсчитать количество агрегатов. Одновременно сделайте репрезентативное изображение под инвертированным сложным микроскопом с 10-кратным увеличением.

Чтобы визуализировать клетки, установите камеру на микроскоп и подключитесь к программному обеспечению для получения изображения. Вручную подсчитайте агрегаты с помощью гемацитометра. Поставьте тарелку на шейкер.

Повторите процесс получения и подсчета изображений через пять минут и 15 минут агрегирования. Выполните количественное определение транссвязывания, рассчитав количество агрегатов на миллилитр между клетками S2 и клетками томата S2-Delta или S2-Serrate в качестве фонового контроля, а также количество агрегатов на миллилитр между клетками томата S2-Notch и S2-Delta или S2-Serrate. Подготовьте сигнальнопринимающие ячейки, поместив пять раз по 10 до пятой части S2-клеток в каждую лунку шестилуночного планшета, по одному миллилитру на лунку дополненной среды Шнейдера.

Добавьте 7,5 микрограммов двухцепочечной РНК в каждую лунку и инкубируйте планшет при температуре 25 градусов Цельсия в течение 24 часов. После инкубации котрансфектируйте двухцепочечные клетки, обработанные РНК, до общей концентрации ДНК в два микрограмма на лунку с использованием коммерческого реагента для трансфекции. Инкубируйте временно трансфицированные клетки S2 при температуре 25 градусов Цельсия в течение 24 часов.

На следующий день добавьте 0,7 миллимолярного сульфата меди, чтобы вызвать экспрессию Notch и лигандов, и инкубируйте при температуре 25 градусов Цельсия в течение трех дней. Подготовьте ячейки, передающие сигнал, как описано в предыдущем разделе. И, наконец, выполните агрегацию между ячейками, отправляющими и принимающими сигнал, как описано ранее.

Резкий рост наблюдался в количестве агрегатов от одной до пяти минут. Затем количество агрегатов продолжало увеличиваться до 30 минут, причем более медленными темпами. Изображения, показывающие агрегацию в трех временных точках, демонстрируют, что двухцепочечные РНК-обработанные РНК клетки S2-Notch EGFP образуют агрегаты с клетками S2-Delta, количество которых со временем увеличивается.

Напротив, фиктивные клетки и двухцепочечные клетки S2-Notch, обработанные РНК, образовывали агрегаты быстрее, и агрегаты были больше и больше по количеству. Это указывает на то, что снижение уровня фикции усиливает транссвязывание Notch с Delta. Трансфекция равных количеств конструкций экспрессии Notch и Delta в клетки S2 значительно уменьшает количество агрегатов, образующихся между этими клетками и клетками S2-Delta.

Более того, уменьшение количества cis-Delta приводит к увеличению количества агрегатов. Это указывает на то, что в диапазоне соотношений Notch/cis-Delta, используемых в этих анализах, cis-Delta может ингибировать связывание между Notch и trans-Delta дозозависимым образом. Количественная оценка относительной агрегации показала сопоставимое ингибирование агрегации при EGFP и фикции двухцепочечной РНК-терапии.

После того, как все реагенты подготовлены, этот анализ является простым и может быть выполнен в течение нескольких часов.