Высоким разрешением объем изображений из нейронов путем использования флуоресценции исключения метод и посвятил Microfluidic приборы

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы обеспечить полное измерение объема нейронов in vitro с субмикрометрическим осевым разрешением, необходимым для анализа нейритов в динамических структурах, участвующих в росте нейронов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной нейронауки, касающиеся динамики изменения объема в субсидиидном масштабе при неросте или дегенерации аксонов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает субмикрометрическое осевое разрешение в сочетании с полным подгонкой наблюдений и временным масштабом до часов или дней.

Чтобы начать процедуру, демолдируйте блок PDMS под химическим колпаком, залив его изопропанолом. Далее поместите его на скамейку из нержавеющей стали вытяжки. Разрежьте вокруг силиконовой пластины и снимите реплику PDMS.

Затем разрежьте вокруг скола и оставьте отступ в два миллиметра с помощью скальпеля или лезвия бритвы. Пробейте впускное отверстие, сильно надавив на перфоратор диаметром 1,5 мм, и приведите его в действие, чтобы вырезать и вырезать отверстие впускного отверстия. Проделайте то же самое в четырех выделенных зонах чипа, куда будет впрыскиваться жидкость.

После этого очистите скол, приклеив и отклеив клейкую ленту с микроструктурированной стороны. Посыпьте изопропанолом с обеих сторон. Затем высушите чипсу азотом под давлением с помощью пневматического пистолета.

В этой процедуре поместите каждый покровный лист на прядильный станок, расположенный в чистом помещении. Нанесите каплю положительного фоторезиста, чтобы покрыть около 75% покровного стекла, и нанесите слой при 4000 об/мин в течение 30 секунд, чтобы достичь конечной толщины 0,45 микрометра. Поместите покровные стекла на конфорку с температурой поверхности 115 градусов Цельсия на одну минуту.

Используя выравниватель маски, экспонируйте каждое покровное стекло на длине волны 435 нанометров через специальную маску в соответствии с производственными параметрами. Далее приготовьте две стеклянные кристаллизующиеся чашки, одна из которых содержит проявитель без разбавления, другая – деионизированную воду. Опустите покровные стекла одну за другой в проявитель на одну минуту, непрерывно и осторожно помешивая кристаллизующуюся форму.

Затем погрузите пластину в деионизированную воду примерно на пять секунд. Переложите на впитывающую бумагу и высушите ее азотом под давлением с помощью пневматического пистолета. Поместите чип PDMS и стеклянную чашку, на которую он будет прикреплен, в плазменную камеру для поверхностной активации.

Далее нанесите каплю воды на прямоугольное толстое предметное стекло микроскопа и наклейте покровное стекло на предметное стекло по капиллярности. Под микроскопом отметьте расположение полос фоторезиста в тыльной стороне предметного стекла. Поместите покровную крышку из узорчатого стекла на держатель маски выравнивателя маски.

Полагайтесь на отметку, сделанную для центрирования опорных объектов фоторезиста. Чтобы увеличить оптический контраст, поместите кремниевую пластину под чип PDMS. Кремниевая пластина должна оставаться прочно прикрепленной к патрону в процессе юстировки.

Затем поместите микросхему PDMS на подвижный держатель подложки выравнивателя маски. Затем поднимите патрон настолько, чтобы визуализировать как чип, так и массив фоторезистных полос, расположенных на защитном стекло, оставаясь при этом за механическим контактом. Выполните выравнивание и обеспечьте механический контакт между чипом и защитным стеклом, подняв патрон до тех пор, пока поверхность стоек PDMS не коснется стеклянного покровного стекла.

После этого опустите патрон. Снимите покровное стекло, прикрепленное к чипу, с держателя маски. Затем поместите устройство в 35-миллиметровую чашку Петри и переложите все в духовку на пять-десять минут, чтобы увеличить прочность склеивания.

Через тридцать минут после склеивания поместите на вход наконечник для пипетки объемом десять микролитров, наполненный раствором PLO. Затем загрузите жидкость до образования капли сверху. Повторите ту же операцию на выходе и резервуарах.

Впоследствии добавьте PBS в чашку Петри по всему периметру чипа. Запечатайте чашку Петри парафиновой пленкой и выдерживайте при комнатной температуре не менее пяти часов. Затем слегка надавите на конус с наконечником объемом десять микролитров в каждое отверстие для впрыска и всосите лишнюю жидкость.

Затем замените PLO, а также PBS, окружающую чип, на питательную среду. После этого поместите чип в инкубатор, регулируемый при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до тех пор, пока нейроны не засеют семена, с минимальным временем инкубации в пять часов. В этой процедуре набирают питательную среду из чипа.

Соберите два-три микролитра свежесуспендированного клеточного раствора и введите его на входе. Сразу же повторите ту же операцию на выходе. Закачивайте примерно одинаковый объем питательной среды в каждый резервуар.

Быстро понаблюдайте за чипом под микроскопом, чтобы проверить плотность ячеек. Порядок величины оптимальной плотности клеток соответствует примерно пяти-десяти ячейкам в пределах квадратной поверхности, ограниченной четырьмя столбами. Повторите процедуру введения от 0,5 до 1 микролитра клеточной суспензии для достижения целевой плотности клеток.

Для визуализации замените питательную среду на среду для визуализации. Затем поместите чип под эпифлуоресцентный микроскоп. Получение изображений клеток от одного до нескольких последовательных изображений в случае покадровых экспериментов.

Здесь показаны репрезентативные наблюдения калибровочной полосы фоторезиста и нейронов. Изображения с большим увеличением и поперечные сечения этих объектов отображаются справа. Здесь показаны типичные нейриты и центральная камера высотой три микрометра.

Объем среза нейрита может быть вычислен как функция ширины нейрита. А вот и представительные конусы роста и центральная камера высотой три микрометра. Их субструктуры четко проявляются из оптического фонового шума около 20 нанометров.

Покадровые наблюдения за жизнью воздействуют на нейроны, засеянные в камеру высотой 12 микрометров, чтобы проследить цикл сжатия и реактивации конуса роста в течение нескольких десятков минут. При попытке выполнить эту процедуру важно иметь доступ к оборудованию для глубокого ионного травления для изготовления кремниевого шлама. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выровнять покровное стекло со структурированным стеклом с помощью чипа PDMS.

После освоения этой техники ее можно воспроизводимо применять для количественной оценки неврологии в 3D. Этот метод проложил путь исследователям в области фармакологии к изучению эффекта различных препаратов с фактическим калибром и все в форме закрытого конуса. Не забывайте, что работа с первичными нейронами требует большой осторожности, чтобы избежать загрязнения и осколков.

Будьте всегда аккуратны и быстры при смене носителя, чтобы ограничить время, которое они проводят вне инкубатора.