Каскад ферментативных реакций синтеза аминокислот хиральных спиртов от L-лизин

Общей целью этой процедуры является синтез и очистка хиральных аминоспиртов, которые представляют собой соединения с широким спектром применения от хиральных вспомогательных спиртов для органического синтеза до фармацевтической терапии. Это всеподатливый измеритель для получения доступа к хиральному аминокислотному спирту, полученному из натуральной аминокислоты лизина в два или три ферментативных этапа в одной части. Основными преимуществами данной процедуры является простота протокола и оперативность этапов очистки.

Демонстрировать процесс будет Орели Фосси-Жуэн, техник из моей лаборатории. Чтобы синтезировать производное дигидроксилированного лизина, добавьте буфер хепса, L-лизин, глутаровую кислоту альпахиты, аскорбат натрия и еще соль в колбу Эрленмайера объемом 250 мл. Затем добавьте воду до конечного объема 10 мл, учитывая объем добавляемого ферментного раствора.

Добавьте дезоксигеназу KD-01 до конечной концентрации 0,075 мг на мл. Встряхните реакционную смесь при комнатной температуре при 300 об/мин в течение соответствующего времени. После смешивания переложите 10 мкл реакционной смеси в пробирку с эпендорфом объемом 1,5 мл.

Затем добавьте раствор бикарбоната натрия aquias, этанол и 2,5 мг на мл раствора DNFB в этанол. Закройте микропробирку и встряхивайте раствор в течение 1 часа при 1000 об/мин и 65 градусах Цельсия. Когда закончите, используйте мини-центрифугу, чтобы успокоить раствор.

Погасить реакционную смесь 10 мкл 1М гидрохлорной кислоты. Смешайте раствор с помощью вихря, а затем используйте мини-центрифугу, чтобы успокоить его. Используя шприц с приманкой объемом 1 мл, отфильтруйте смесь на нестерильном шприц-фильтре диаметром 4 мм с гидрофильной мембраной из поливинилиденфторида размером 0,22 мкм.

После этого поместите образец деривитизированной реакционной смеси в прибор для ВЭЖХ. Введите 10 мкл в колонку C-18 с помощью ультрафиолетового детектирования на 400 нанометрах для анализа продукта. Когда мониторинг реакции покажет завершение реакции, добавьте в колбу глутаровую кислоту alphaquita, аскорбат натрия и еще соли.

Добавьте дезоксигеназу KD-02 в соответствующую конечную концентрацию 0,5 мг/мл. Рассчитано с использованием начального объема реакции. Встряхните реакционную смесь при комнатной температуре при 300 об/мин в течение 18 часов.

Когда мониторинг реакции покажет завершенную реакцию, добавьте 100 мкл 100 миллимолярного DTT в реакционную смесь. Плюс 100 мкл 100 миллимолярных PLP. Добавьте очищенную декарбоксилазу Dccpin в приблизительной конечной концентрации 0,5 мг на мл.

Рассчитывается с использованием начального объема реакции. Затем встряхните реакционную смесь при комнатной температуре при 300 об/мин в течение 18 часов. Как только реакция завершится, охладите смесь, поместив колбу в ледяную баню.

Осторожно добавьте 0,25 мл 6 моляров HCL и осторожно встряхните холодную реакционную смесь во время добавления. Теперь переложите акдиковую смесь в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл с помощью стеклянной пастбищной пипетки. Центрифугируйте смесь при давлении в 1,680 раз и 4 градусах Цельсия в течение 15 минут.

После центрифугирования переложите надосадочную жидкость в колбу с круглым дном объемом 250 мл. Затем добавьте 10 мл деионизированной воды в центрифужную трубку, содержащую гранулу. Vortex для повторного суспендирования гранулы.

После центрифугирования образца переложите надосадочную жидкость в круглую донную колбу, содержащую первую надосадочную жидкость. Заморозьте собранные надосадочные жидкости, всплывая из колбы в жидкий азот при постоянном ручном закручивании. Немедленно перенесите колбу в сублимационную сушилку с настольным коллектором, чтобы предотвратить оттаивание материала.

После завершения процесса сублимационной сушки извлеките колбу из сублимационной сушилки и выполните этапы очистки. Для биокаталитического декарбоксилирования моногидроксильных L-лизинов DC из S Rhumerentium проявляет активность по отношению ко всем моногидроксилизинам. Где наилучшая конверсия наблюдается для трех и пяти производных соответствующих хиральных гидрокси-диаминов.

Как и ожидалось, Dccpin оказался наиболее подходящим для декарбоксилирования 4R-гидрокси-L-лизина 2. В стандартных условиях реакции превращение 3S-гидрокси-L-лизина 1 в его декарбоксилированный аналог 5 с DCcpin было низким. При этом не наблюдалось никакой активности в отношении 5R-гидрокси-L-лизина.

Для биокаталитического декарбоксиилирования дегидрокси-L-лизинов только 3R, 4R, дигидрокси-L-лизин 3 количественно превращали в соответствующий дигидрокси-диамин 7 в стандартных условиях реакции. Конверсия 45-дигидрокси-L-лизина 8 была умеренной, но улучшалась за счет увеличения ферментативной нагрузки. Ни один из PLP-DC не был активен по отношению к 35-дигидрокси-L-лизину 9.

Ферментативные каскадные реакции, демонстрирующие количественную конверсию по данным мониторинга ВЭЖХ, были успешно масштабированы. Аминоспирты были очищены от сложных ферментативных реакционных смесей и превосходных кислот и характеризовались методом ЯМР. После освоения этого ферментативного каскада синтез и последующая очистка могут быть выполнены в течение 48 часов, если он правильно сформирован.

При попытке проведения этой процедуры важно помнить, что хорошее насыщение кислородом основного реакционного вещества имеет важное значение для диоксигенированных реакций. А также тщательный мониторинг, чтобы убедиться, что весь лизин употреблен перед добавлением дикарбоксидазы. Основным недостатком данного протокола являются ограниченные субсидируемые диапазоны фермента диоксигеназы и декарбоксилазы.

Тем не менее, биочаталитный синтез различных аминокислот из аминокислот может быть изучен с помощью другого набора ферментов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить ферментативную каскадную реакцию и как очищать аминоспирты от сложных реакционных смесей. Не забывайте, что работа с DNFB может быть опасной, и в противном случае следует принимать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты и предотвращение реакции в вытяжном шкафу.