Методы для промежуточной куколки периодов и измерение крыла пигментации Drosophila guttifera

Общая цель этого эксперимента — определить стадию периодов куколки и измерить пигментацию крыльев Drosophila guttifera. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эволюционной биологии развития, например, как развиваются паттерны пигментации у дрозофил. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем получить подробную информацию о морфологическом развитии и процессе пигментации.

Хотя этот метод может дать представление о морфологическом развитии и процессе пигментации дрозофилы guttifera, он может быть применен к другим видам дрозофил. Чтобы начать удаление пупария, прикрепите кусок двустороннего скотча к листу бумажного полотенца. Поместите куколку на двусторонний скотч брюшной стороной вверх.

Найдите пространство между передней стороной пупария и внутренней куколкой. Захватите и удалите пупарий вокруг этого промежутка с помощью щипцов. И обнажите переднюю сторону головы куколки.

Введите кончик щипца, переместив его параллельно передне-задней оси. Поднимите кончик щипцов, чтобы локально сломать пупарий. Повторяйте это действие до тех пор, пока поломка не достигнет задней части пупария.

Следите за тем, чтобы между пупарием и ножками куколки образовался зазор. И сломать брюшную сторону пупария, минимизировав при этом повреждение внутренней куколки. Разбив пупарий как можно сильнее, выньте куколку с помощью тонкой малярной кисти.

Поместите куколку на лист папиросной бумаги, смоченный ddH2O, и поместите его в пластиковую чашку Петри. Сразу же делайте фотографии, так как выставленная куколка уязвима и легко сохнет. Приступайте к подготовке изображения и удалите переднюю часть пупария с помощью щипцов.

Выньте куколку и поместите ее в фосфатно-солевой буфер (PBS) в пластиковой чашке Петри. Далее разрежьте базальный стык крыла. Когда крыло сложено, поместите его в пластиковую чашку Петри, наполненную ddH2O, чтобы удлинить его под действием осмотического давления.

Собирайте только что вложенных взрослых особей раз в 10 минут из папки. Обезболите муху с помощью анестезирующей салфетки с CO2. Подтвердите обезболивание неподвижностью и разрежьте базальный сустав крыла.

Капните 10 микролитров PBS на предметное стекло. Поместите крыло в каплю. И накрываем каплю покровной крышкой.

Далее включаем свет стереомикроскопа и устанавливаем его на максимум. Установите объектив на 11,5x и установите диафрагму в максимально открытое положение. Затем включите камеру и установите камеру.

Сфокусируйтесь на образце, перемещая ручку фокусировки микроскопа. Нажмите кнопку спуска затвора на пульте дистанционного управления, чтобы сделать снимок. Возьмите изображение крыла, центрированного колокольчатым сенсиллумом, расположив дистальную часть крыла с левой стороны и внутреннюю часть крыла с верхней стороны.

Откройте изображение с кампаниформным пятном сенсиллума в центре. Нажмите кнопку Изображение, введите 1, 8-разрядная, чтобы преобразовать изображение в 8-разрядное. Нажмите на прямоугольник в инструментах выделения области и нарисуйте прямоугольник.

Установите правую сторону прямоугольника так, чтобы она располагалась справа от пятна колокольчатого сенсиллума. Нажмите «Редактировать», «Выбрать», «Добавить в менеджер», затем установите флажок в столбце «Показать все». Далее нажмите инструмент «Угол» в инструменте выделения линий.

Первую линию проведите по задней линии третьей продольной вены. Установите левые конечные точки линии на вершине ранее нарисованного прямоугольника. Нарисуйте вторую линию на верхней стороне прямоугольника.

Нажмите клавишу M, чтобы измерить угол между двумя линиями, нарисованными на этом шаге. Нажмите на окно изображения на экране компьютера. Нажмите Редактировать, Выбрать, Добавить в Менеджер.

Нажмите на прямоугольник в инструментах выделения области и нарисуйте прямоугольник примерно в 1/9 размера окна изображения. Нажмите «Редактировать», «Выделить», «Повернуть». Запишите минус градусы ранее измеренного угла в столбце Угол и нажмите OK, чтобы повернуть прямоугольник, нарисованный на этом шаге.

Переместите прямоугольник, нарисованный с помощью клавиш со стрелками, и установите конечную точку задней линии второй продольной вены на левой стороне прямоугольника. А нижнюю сторону прямоугольника приложите к задней линии третьей продольной вены. Подтвердите перпендикулярную линию от конечной точки второй продольной вены до задней линии третьей продольной вены.

Определите нижнюю часть перпендикулярной линии как точку A.Запишите координаты X и Y точки A, указанные ниже инструментами выделения области при наведении курсора на точку A.Откройте изображение с точкой A в центре. Нажмите кнопку Изображение, Тип, 8-разрядная, чтобы преобразовать изображение в 8-разрядное. Нажмите на прямоугольник в инструментах выделения области и нарисуйте прямоугольник размером примерно 1/9 размера окна изображения.

Нажмите Редактировать, Выделить, Указать. Отметьте Овальный и Центрированный столбец. Запишите 100 пикселей в столбцы ширины и высоты.

Запишите координаты X точки A в столбец координат X, а координаты Y точки A — в столбец координат Y, затем нажмите OK. Затем нажмите «Анализ и измерение». Если калибровка уже завершена, OD указываются в столбце Mean. Сравнение данных нескольких стадий показало, что стадия Р12 является временем начала пигментации и что пигментация завершается через 12 часов после эклозии.

После своего развития этот метод открывает исследователям в области эволюционной биологии развития путь к изучению различий в развитии куколок и процессе пигментации среди видов дрозофил.