Характеристика опухолевых клеток с помощью медицинская проволока для захвата циркулирующих клеток опухоли: 3D подход, основанный на иммунофлюоресценции и ДНК рыбы

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы объединить иммунофлуоресцентное окрашивание с флуоресцентной ДНК-гибридизацией in situ на 3D-функционализированной проволоке и идентифицировать иммунофенотип и сигналы FISH на носителе с помощью обычного широкопольного флуоресцентного микроскопа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области определения характеристик опухолевых клеток, таких как идентификация мишеней, связанных с терапией, на циркулирующих клетках немелкоклеточного рака легкого. Основным преимуществом этого протокола является возможность одновременной идентификации фенотипических параметров, таких как положительный результат EpCAM, и цитозоматических изменений, таких как статус гена ARC, для выявления предполагаемых ЦОК.

Несмотря на то, что этот метод был специально разработан для обеспечения in situ особенностей ЦОК при раке инсулина, он также может быть применен для изучения других видов рака, таких как рак молочной железы. Мы разработали этот протокол во время работы с проводом для прямого иммунофенотипирования и обнаружения ЦОК. Чтобы получить больше данных, мы связали протокол иммунофенотипирования с протоколом флуоресцентной ДНК-гибридизации in situ.

Обращаться с проволокой непросто, в основном потому, что функциональный наконечник хрупкий. В визуальной демонстрации читатели будут воспроизводить шаги. Чтобы начать эксперимент, суспендируйте все содержимое колбы Т75, находящейся на 80% конфузии в пятимиллилитровом флаконе, используя четыре миллилитра полной среды.

Далее извлеките провод из его стеклянной упаковки. Опустите функционализированную золотую часть проволоки во флакон, убедившись, что стопор проволоки является водонепроницаемым прилеганием к флакону объемом пять миллилитров. Заклейте провод лабораторной пленкой.

Затем инкубируйте проволоку в трубчатом ротаторе в течение 30 минут при комнатной температуре. После вращения трижды промойте провод в однократном растворе PBS с использованием трех разных чистых флаконов и подождите, пока провод высохнет. После сушки проволоки на воздухе в течение 10 минут в вытяжке зафиксируйте ячейки, опустив проволоку в 100% раствор ацетона в пятимиллилитровую пробирку на 10 минут при комнатной температуре.

Убедитесь, что на функционализированном наконечнике нет следов ацетона. Просушка провода на воздухе в течение пяти минут при комнатной температуре. Далее в пятимиллилитровой трубке промойте провод дважды в одностворчатом ПБС.

Инкубируйте проволоку в буфере для разведения антител. Приготовьте 150 мкл смеси антител с разведением моноклонального первичного антитела, конъюгированного с флуорохромом и буфером для разведения антител, указанным в техническом описании. Затем с помощью наконечника P200 извлеките проволоку из стопора проволоки и аккуратно вставьте проволоку через большее отверстие наконечника.

Сначала вставьте нефункциональный конец и медленно протяните проволоку через меньшее отверстие, пока золотая часть не окажется сразу за большим отверстием. Аккуратно добавьте 150 микролитров смеси антител в наконечник. Чтобы избежать риска образования пузырей, осторожно поворачивайте проволоку до тех пор, пока функционализированный конец полностью не погрузится.

Заклейте отверстие наконечника и оберните отверстие лабораторной пленкой. Инкубируйте проволоку вертикально на ночь в темноте при температуре четыре градуса Цельсия. На второй день заблокируйте инкубацию антител, дважды промыв проволоку в однократном PBS.

Вставьте проволоку обратно в стопор для проволоки. За три часа до протокола DNA-FISH установите гибридизационную печь на 75 градусов Цельсия и установите сушильную печь на 37 градусов Цельсия. Охладите 0,4-кратный раствор SSC до четырех градусов Цельсия.

Промойте провод три раза в ледяном 0,4-кратном растворе SSC. Просушите провод в темноте под шкафом вытяжного шкафа в течение 10 минут. Через 10 минут сделайте вихрь и раскрутите щуп в течение пяти секунд.

Капните 10 микролитров зонда в стеклянные микропробирки, затем накройте их лабораторной пленкой. Оберните микротрубки сухой впитывающей бумагой. Поместите в трубку объемом 50 миллилитров и коротко покрутите их.

Аккуратно поместите высушенную проволоку в микротрубку и вставьте проволочный стопор. Затем загерметизируйте проволочный стопор резиновым цементом. Поместите проволоку в темную влажную камеру в печи для гибридизации на восемь минут при температуре 75 градусов Цельсия, чтобы получить полную денатурацию ДНК.

Через восемь минут переместите влажную камеру в духовку с сухим жаром при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. Поместите банку для окрашивания предметного стекла с 0,4-кратным раствором SSC на водяную баню, установленную при температуре 72 градуса Цельсия. Проверяйте 0,4-кратную температуру раствора SSC до тех пор, пока она не достигнет 72 плюс-минус один градус Цельсия.

Далее подготовьте два стеклянных стакана. Один с двукратным SSC плюс 0,05% раствор Tween, а второй с дистиллированной водой. Снимите влажную камеру для духовки с сухим жаром.

С помощью пинцета осторожно удалите резиновый цемент с проволочного стопора и протяните непокрытый конец проволоки через концевой стопор, стараясь не повредить функционализированный кончик. Опустите проволоку в 0,4-кратный раствор SSC на две минуты при температуре 72 градуса Цельсия. Промойте провод в двукратном растворе SSC плюс 0,05% Tween в течение 30 секунд при комнатной температуре.

Затем промойте провод в дистиллированной воде комнатной температуры. Просушите провод под вытяжным шкафом в течение 10 минут в темноте. Функционализированный кончик проволоки инкубируйте с заранее приготовленным раствором DAPI в двухмиллилитровом флаконе.

Дважды промойте проволоку в одном сгибе PBS и высушите проволоку на воздухе. Поместите провод в держатель провода и осторожно вставьте функционализированный наконечник через точку входа специального держателя до тех пор, пока наконечник не совпадет с точкой соединения. Поместите специальный держатель на предметный столик микроскопа.

Отрегулируйте фокусировку микроскопа с помощью 20-кратного объектива. Сначала грубо сфокусируйтесь на специальной подставке, а затем тонко отрегулируйте ячейки, которые кажутся яркими в канале DAPI. Фокусируйте только ячейки, расположенные по центру объектива, и получайте изображения с помощью 12-разрядной цифровой камеры с объективами 20x и 40x с соответствующими фильтрами для красных, зеленых и синих щупов.

Наконец, подготовьте проволоку к длительному хранению, упаковав проволоку рядом с функционализированным наконечником, и осторожно вставьте проволоку в стеклянную трубку. Храните проволоку вертикально или горизонтально при температуре минус 20 градусов Цельсия. Иммунофлуоресцентное окрашивание не влияло на сигналы DNA-FISH.

Когда анализ иммуно-ДНК-FISH был выполнен на функционализированной проволоке с 3D-поддержкой, окрашивание EpCam было четко видно. Зонд ALK выявил делецию гена. Клеточная линия NCI-H3122 показала аберрантный статус гена LAK в отличие от NCI-H1975 с диким типом ALKG.

После освоения этот протокол может быть выполнен за девять рабочих часов в течение трех дней. При попытке выполнить эту процедуру важно не прикасаться к функционализированной части провода, чтобы предотвратить повреждение. В соответствии с этим протоколом можно использовать различные антитела и зонды FISH для ответа на дополнительные вопросы, такие как идентификация клеток с другими фенотипическими маркерами и другими цитогенетическими изменениями, такими как амплификация генов NAT или HAR2.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как одновременно идентифицировать предполагаемые ЦОК с помощью фенотипических параметров, таких как положительный результат EpCAM, и обнаруживать цитогенетические изменения, такие как статус гена ARC. Не забывайте, что работа с ацетоном и духовкой может быть крайне опасной. Во время выполнения этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как обращение с ацетоном в капюшоне и ношение защитных перчаток.