Простой и быстрый метод для получения высокого качества опухоли ДНК от клинических патологических образцов с помощью касания отпечаток цитологии
21 марта 2018 г.
Получение высококачественных геномной ДНК опухолевых тканей является важным первым шагом для анализа генетических изменений, с помощью следующего поколения последовательности. В этой статье мы представляем простой и быстрый способ обогатить опухолевых клеток и получить нетронутыми ДНК от прикосновения отпечаток цитологии образцов.
Общей целью данного протокола является получение высококачественной опухолевой ДНК из клинических образцов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы фундаментальной и клинической науки, такие как исследование рака, диагностика и принятие решений о лечении. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем получить опухолевую ДНК проще и быстрее, чем с помощью предыдущих методов.
Для начала протокола несколько раз коснитесь поверхности опухоли заранее подготовленной и резецированной ткани на обычном предметном стекле руками в перчатках. Визуально убедитесь, что прикасаемая область покрывает более 80% стекла. Слегка прижмите обычное стеклянное стекло к предметному стеклу из полиэтиленнафталата или PEN-мембраны и осторожно потрите его два-три раза руками в перчатках.
Визуально подтвердите, что клетки переносятся с обычного предметного стекла на предметное стекло PEN-мембраны. Высушите стекло и PEN-мембрану на воздухе в течение пяти минут при комнатной температуре. После высыхания окрашивают обычное стеклостекло для непосредственного цитологического исследования.
Опустите стекла в фиксирующий раствор на пять секунд, а затем окрасьте раствором для окрашивания Giemsa в течение 15 секунд. Оцените и просмотрите содержимое опухоли и клеточную проницаемость на обычном предметном стекле полностью с помощью микроскопа для быстрой оценки. Оценивайте опухолевые клетки на основе нескольких критериев.
Если образец показывает клеточность опухоли более 60% при быстрой микроскопической оценке из предыдущего среза, разрежьте затронутую опухолью пленку стекол мембраны PEN для извлечения ДНК ножом и руками в перчатках. Переложите отрезанную пленку в стерильную микроцентрифужную пробирку с помощью набора булавок и рук в перчатках. Храните пленчатую микроцентрифужную пробирку при температуре четыре градуса Цельсия до извлечения ДНК.
Откройте программное обеспечение, спланируйте условия выполнения и установите параметр запуска в программном обеспечении. Перейдите на вкладку плана и выберите шаблон, затем выберите подходящий метод выполнения. Выберите область применения и тип техники и нажмите кнопку «Далее».
Выберите прибор, комплект для подготовки образцов, тип библиотечного набора, набор шаблонов, комплект для секвенирования, режим базовой калибровки, тип чипа, последовательность управления и набор штрихкодов и нажмите «Далее». Выберите плагины и нажмите далее. Выберите проект и нажмите далее.
Затем выберите эталонные и BED файлы по умолчанию для целевой области. Введите имя образца, выберите штрихкод и нажмите кнопку «Запланировать выполнение». Далее выполните подготовку шаблона и загрузку чипа в автоматизированный прибор в соответствии с инструкциями производителя.
Разморозьте картридж с реагентом при комнатной температуре в течение 45 минут перед использованием. Разбавьте неразбавленную библиотеку безнуклеазной водой в соответствии с концентрацией библиотеки, рассчитанной на шаге 6.8, и сделайте 20 пикомолярных библиотек. Подготовьте объединенную библиотеку для секвенирования и храните ее на льду.
Добавьте 25 микролитров объединенной библиотеки с помощью пипетки объемом 100 микролитров на дно пробирки с образцом. Включите питание и откройте крышку автоматического прибора. Поместите чип секвенирования, адаптер чипа, картридж для обогащения, картридж с наконечником, планшет для ПЦР, уплотнение рамки для ПЦР, пробирку для восстановления, картридж с раствором и картридж с реагентами в соответствующее положение автоматизированного прибора.
Коснитесь кнопки «Настройка», «Бег» и пошагово перемещайтесь по экрану. Закройте крышку и нажмите «Начать проверку» на экране. После завершения сканирования деки нажмите кнопку Далее.
Проверьте содержимое дисплея, тип комплекта, идентификатор чипа, идентификатор образца, тип чипа, планы. Установите время и нажмите OK. После завершения загрузки чипа нажмите на кнопку «Далее» и откройте крышку. Выгрузите микросхему секвенирования из адаптера микросхемы руками в перчатках.
Поместите чип в контейнер для чипсов, оберните его парапленкой и храните чип при температуре четыре градуса Цельсия до реакции секвенирования. Затем снимите картридж для обогащения, планшет для ПЦР, уплотнение рамки для ПЦР, пробирку для восстановления, картридж с раствором и картридж с реагентами с соответствующего положения автоматизированного инструмента руками в перчатках. Перенесите картридж с пустым наконечником в положение отработанного наконечника автоматического инструмента руками в перчатках.
Нажмите «Далее» и закройте крышку. Затем нажмите кнопку запуска и очищайте автоматический прибор ультрафиолетовыми лучами в течение четырех минут. Растворите таблетку хлорита натрия в 1 000 миллилитрах сверхчистой воды и отфильтруйте раствор фильтром 0,22 микрона.
После того как инструмент для секвенирования нагреется, коснитесь его на очистке и далее на экране секвенсора. Очистите инструмент для секвенирования 250 миллилитрами стерилизованного фильтром раствора хлорита натрия, затем 250 миллилитрами сверхчистой воды. Затем нажмите «Инициализировать» и выберите соответствующий набор секвенирования на экране.
Установите серый шиппер с руками в перчатках. Инициализируйте прибор для секвенирования с помощью промывочного раствора, раствора для корректировки pH и стандартного раствора pH. Затем добавьте 20 микролитров нуклеотидов DATP, DGTP, DCTP и DTTP в 50 миллилитровых пробирках с помощью пипетки объемом 100 микролитров.
Установите серый шиппер в нужном месте с помощью рук в перчатках. Загрузите трубку объемом 50 миллилитров и прикрутите ее к инструменту для секвенирования. Нажмите кнопку «Далее» на экране, чтобы начать этап инициализации.
После завершения шага инициализации нажмите кнопку «Выполнить» на экране и выберите подходящий инструмент подготовки библиотеки. Отсканируйте двухмерный штрих-код чипа. Вставьте чип последовательности в соответствующее положение.
Закройте зажим для стружки и дверцу прибора и коснитесь проверки стружки, затем и нажмите OK на экране, чтобы начать выполнение секвенирования. После реакции секвенирования передайте данные и выполните конвейер анализа данных на сервере секвенирования. Абсолютные количества ДНК и значение RQ, являющееся показателем уровня деградации геномной ДНК, показывают, что при использовании образцов TIC достигается более высокий выход ДНК по сравнению с образцами FFPE.
Кроме того, значения RQ из ДНК TIC были значительно выше по сравнению с ДНК FFPE для различных типов опухолей. APC Q1367* был идентифицирован как в FFPE, так и в ДНК TIC, выделенной из первого сайта, и APC S1356*KRAS G12D, а TP53 M237i был обнаружен как в FFPE, так и в TIC DNA, выделенных из второго, третьего и четвертого сайтов, что позволяет предположить, что идентичные соматические мутации были идентифицированы в парных образцах FFPE и TIC DNA, полученных из одного и того же опухолевого участка. Примечательно, что те же соматические мутации были обнаружены между первичным колоректальным раком и двумя метастатическими образцами рака печени, что позволяет предположить, что опухоль клонируется со второго участка метастазирования в печень.
После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области молекулярных и медицинских исследований для выявления генетических раковых заболеваний.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен экспресс-метод получения высококачественной геномной ДНК из опухолевых тканей с использованием образцов цитологических отпечатков. Этот метод упрощает процесс обогащения опухолевыми клетками, облегчая проведение генетического анализа с помощью секвенирования следующего поколения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Экстракция геномной ДНК
- Исследования рака
- Секвенирование следующего поколения
Теоретические сведения
- Высококачественная ДНК имеет решающее значение для анализа генетических изменений.
- Традиционные методы экстракции ДНК могут быть сложными и трудоемкими.
- Цитология по отпечатку (Touch imprint cytology) — это метод, который позволяет упростить данный процесс.
- Этот метод обеспечивает быстрый и эффективный сбор опухолевой ДНК.
Цель исследования
- Разработать простой метод выделения опухолевой ДНК.
- Повысить эффективность генетического анализа в исследованиях рака.
- Предложить надежный протокол для клинического применения.
Используемые методы
- Прикосновение поверхностью опухоли к предметному стеклу.
- Обеспечение покрытия более 80% площади стекла.
- Перенос отпечатка на предметное стекло с PEN-мембраной.
- Осторожное протирание стекла для сбора клеток.
Основные результаты
- Данный метод позволяет эффективно обогащать популяцию опухолевых клеток.
- Высококачественная ДНК может быть получена в короткие сроки.
- Эта методика проще, чем предыдущие методы.
- Она имеет потенциал применения в диагностике и лечении рака.
Заключение
- Данный протокол предлагает экспресс-метод экстракции ДНК.
- Он может способствовать проведению важных исследований в области генетики рака.
- Этот метод может улучшить процесс принятия клинических решений в онкологии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Получение высококачественной опухолевой ДНК является критически важным этапом для молекулярного профилирования и выбора таргетной терапии при разработке онкологических препаратов. Метод цитологии методом отпечатка (touch imprint cytology, TIC) позволяет быстро и надежно экстрагировать неповрежденную геномную ДНК из клинических образцов, преодолевая ограничения, характерные для образцов, фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE). Данная возможность повышает прогностическую достоверность последующих генетических анализов и ускоряет процесс принятия решений на этапах поиска и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Обеспечивает надежный анализ мутационного статуса опухоли для валидации мишени.
- Снижает биологическую неопределенность за счет получения ДНК более высокого качества по сравнению с образцами FFPE.
- Позволяет с уверенностью идентифицировать значимые генетические изменения для приоритизации портфеля препаратов.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает подготовку валидированной опухолевой ДНК для секвенирования следующего поколения и ПЦР-анализов.
- Повышает воспроизводимость и стандартизацию анализа за счет обеспечения целостности и количества ДНК.
- Позволяет сократить время выполнения генетического тестирования, поддерживая высокопроизводительные рабочие процессы скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует задачам поиска биомаркеров, имеющих значение для диагностики заболеваний, за счет сохранения опухолеспецифических генетических сигнатур.
- Обеспечивает непрерывность процесса от получения клинического образца до валидации доклинической модели.
- Снижает риски трансляционных исследований, сводя к минимуму деградацию образцов и потерю данных.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод TIC интегрируется на стыке забора клинических образцов и молекулярного анализа, обеспечивая рабочие процессы от этапа первичного поиска до трансляционных исследований.
- Биологические исследования: обеспечение высококачественной ДНК для проверки гипотез и анализа сигнальных путей.
- Скрининг: получение воспроизводимого количественного материала ДНК для секвенирования и ПЦР-анализов.
- Аналитика: возможность точного определения мутационного статуса и показателей качества ДНК (например, значения RQ).
- Трансляционные исследования: сохранение генетической точности для изучения биомаркеров и механизмов заболеваний.
- Корпоративное использование: наличие стандартизированного экспресс-протокола, применимого для различных типов опухолей и исследовательских центров.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в генетических анализах.
- Операционная ценность: Оптимизирует экстракцию ДНК за счет использования быстрых, воспроизводимых рабочих процессов и минимизации потерь образца.
- Стратегическая ценность: Ускоряет принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает риски на поздних стадиях за счет повышения качества данных.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию молекулярных мишеней и терапевтических кандидатов с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области цитологической оценки и протоколов экстракции ДНК.
- Необходим доступ к микроскопии, предметным стеклам с мембраной PEN и оборудованию для секвенирования.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами в вопросах обработки образцов и оценки качества.
- Метод применим к различным типам опухолей, но зависит от достаточной клеточности опухолевой ткани.
- Ограничением является необходимость наличия резецированной ткани и проведения первичной цитологической оценки.
