Визуализация Lignification динамика в растениях с нажмите химия: двойная маркировка, БЛАЖЕНСТВО!

Общая цель этой методологии двойного мечения заключается в наблюдении за активно одревесневающими зонами растительных тканей. В этом рабочем процессе стратегия химического репортера применяется с использованием двух различных химических репортеров в последовательной комбинации биоортогональных клик-химических реакций. Этот метод может помочь расшифровать ключевые вопросы в области биологии растений, такие как определение того, какие факторы регулируют пространственное или временное образование лигнина в растениях и стенах.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он нацелен исключительно на лигнин, который вырабатывается во время метаболического включения. Это отличает его от любого ранее существовавшего лигнина в образце. Хотя первоначально мы разработали этот метод для изучения флагов одревеснения, его можно использовать с другими видами, такими как арабидопсис, тополь или любое другое растение, которое производит лигнин.

Чтобы представить эту технику, у нас есть Клеменс Саймон, аспирант, работающий на стыке химии и биологии и использующий эту технику для изучения динамики одревеснения. Сначала приготовьте 300 микролитровый раствор химического репортера, содержащий десять микромюллеров G-репортеров с алкиновой меткой. И десять микромюллеров меченного азидом H репортера и жидкой стерильной 1/2 MS среды.

Сделайте раствор вихревым и перенесите его в одну лунку 48-луночного планшета с помощью передаточной пипетки. Приготовьте отрицательный контрольный раствор объемом 300 мкл, содержащий десять микромюллеров G и десять микромюллеров H, а также жидкую стерильную среду 1/2 MS. Переведите раствор в вихрь и переложите его во вторую лунку того же 48-луночного планшета.

Используя чистое лезвие бритвы, срежьте стебель двухмесячного растения льна на десять сантиметров выше уровня почвы. Усердно подготовьте 50 поперечных сечений стебля свободной рукой с помощью лезвия бритвы и немедленно поместите их в среду с концентрацией 1/2 мс. Затем выберите целые поперечные сечения и случайным образом распределите десять из них в лунке, заполненной раствором химического репортера, стараясь не повредить ткани.

Поперечные сечения должны быть плотно и чисто срезаны, а поперечное сечение должно быть прямым. Вам нужна твердая рука и острое лезвие бритвы для того, чтобы сохранить ткани в целости. Рекомендуется потренироваться заранее.

После распределения десяти неповрежденных сечений в отрицательном контрольном растворе инкубируйте планшет при постоянном освещении в камере роста при температуре 20 градусов Цельсия в течение 20 часов. На следующий день удалите раствор монолигнала из каждой лунки с помощью микропипетки. Добавьте в каждую лунку по 500 микролитров 1/2 MS medium и аккуратно помешивайте в течение десяти минут.

Затем удалите раствор для полоскания с помощью микропипетки. Приготовьте один миллилитр продувочного раствора циклоприсоединения азид-алкина. Содержит пять микромюллеров флуоресцентного красителя, меченного циклооктеном, и жидкую стерильную среду 1/2 МС.

Затем сделайте раствор вихрем. После заключительных этапов промывки протокола метаболического включения удалите 1/2 MS среды и добавьте 300 микролитров раствора SPAAC в каждую лунку с помощью микропипетки. Защитите 48-луночный планшет от света, поместив его в коробку.

Затем аккуратно перемешайте тарелку на механическом вибростенде в течение часа в темноте при температуре окружающей среды. После этого промойте каждую лунку четыре раза 1/2 MS средством, как описано ранее, сохраняя при этом тарелку в темноте. Приготовьте один миллилитр катализируемого медью раствора циклоприсоединения азида алкина, содержащего аскорбат натрия, сульфат меди и флуоресцентный краситель с азидной меткой, а также жидкую стерильную среду в дозе 1/2 мс.

Затем сделайте раствор вихревым. После удаления 1/2 мс-среды поместите планшет в коробку и добавьте 300 микролитров раствора CuAAC в каждую лунку с помощью микропипетки. Аккуратно помешивайте тарелку на механическом вибростенде в течение часа в темноте при температуре окружающей среды.

Снимите пластину с механического шейкера и удалите раствор CuAAC из каждой лунки с помощью микропипетки. Затем добавьте 500 микролитров 1/2 МС среды и перемешайте тарелку на механической шейкере в течение десяти минут в темноте. После еще двух промываний средой 1/2 МС добавьте в каждую лунку по 500 микролитров раствора метанола 7:3 и воды.

Перемешивайте тарелку на механической шейкере в течение часа в темноте. Затем удалите раствор из лунок. Далее в каждую лунку добавляем по 500 микролитров 1/2 МС среды и размешиваем в темноте в течение десяти минут.

Повторив эту стирку четыре раза, храните срезы в среде 1/2 мс, защищенной от света. Поместите пять капель монтажного средства на предметное стекло микроскопа. Затем аккуратно нанесите на предметное стекло каждое поперечное сечение, помеченное как репортер по химическому

Нанесите лак для ногтей с двух противоположных сторон горки. Закройте слайд защитным затвором, стараясь не допустить появления пузырьков воздуха. Затем удалите излишки монтажного материала с помощью бумажного полотенца.

После этого заклейте образец лаком для ногтей со всех четырех сторон. После того как лак для ногтей высохнет, храните предметные стекла при температуре четыре градуса Цельсия в темноте до наблюдения под конфокальным микроскопом. Срезы растений имеют тенденцию становиться хрустящими при высыхании.

Следите за тем, чтобы они всегда находились в растворе, и заклейте покровные стекла лаком для ногтей со всех сторон. Это увеличивает срок хранения смонтированных горок. Поместите предметное стекло на предметное стекло микроскопа под объектив.

Наблюдайте и вращайте образец, чтобы определить желаемый участок растительной ткани. Далее выберите самую флуоресцентную плоскость по оси Z. Регулируйте усиление, смещение и мощность лазера для достижения оптимального распределения сигнала по всему диапазону уровней серого для каждого канала.

Наконец, получите высококачественные конфокальные изображения. BLISS предоставляет три цветовые карты локализации лигнина в клеточных стенках растений, нацелен исключительно на лигнин, произведенный in novo во время метаболического включения, и дифференцирует его от ранее существовавшего лигнина в образце. Он выделяет активные участки одревеснения в различных тканях органа в пределах разных типов клеток ткани или в различных слоях стенки или субструктурах клетки.

Помеченные алкинами G и азидами H репортерные профили от камбия до сердцевины во вторичной ксилеме льна указывают на то, что максимальная одревеснение быстро достигается в волокнистых трахеидах во время развития, в то время как расовые клетки продолжают включать лигнин на гораздо более поздних стадиях своей жизни. Изменение соотношения химических репортеров показывает, что состав лигнина во вторичных тканях ксилемы напрямую зависит от доступности монолигнала в клеточных стенках. А не на пероксидазную или лакказную специфичность при полимеризации лигнина.

Включение химических репортеров ограничено углами клеток и первичной клеточной стенкой средней пластинки некоторых, но не всех лубяных волокон. В корнях льна химические репортеры встраиваются в стенки эндодермальных клеток, где отсутствует каспарная лента. Для лучшей визуализации архитектуры тканей также можно создавать реконструкции в формате 3D Z.

После этого визуально также может быть выполнена комплексная обработка данных. Все меры предосторожности приняты, можно получать постоянные результаты путем относительного сравнения, считывая образец между разными образцами. Это может быть сделано в дополнение к локализации активного ведения различных участков.

Этот метод является замечательным инструментом для биологов растений, таких как я, которые изучают клеточную стенку. Как только он будет освоен, это можно будет сделать за несколько часов. Он очень чувствителен и может быть применен к целому ряду различных экспериментальных модельных систем in vitro.

Применение стратегии химического репортера к лигнину открывает химическим биологам путь к изучению динамики лигнификации и выяснению того, что контролирует этот процесс полимеризации, который во многих отношениях все еще представляет собой неизведанную территорию.