Визуализация лейкоцита прокатки и адгезии в ангиотензин II-проникнуты мышей: приемы и ловушки

Общей целью данной эпифлюоресцентной прижизненной видеомикроскопии, или протокола ИВМ кровеносных сосудов, является визуализация и количественное определение скручивания и адгезии лейкоцитов в корродированных артериях при ангиотензин-индуцированной II гипертензии у мышей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в патологии сосудистой дисфункции и артериальной гипертензии, такие как механизм взаимодействия лейкоцитов с лизосомами и положительными клетками, а также работа сосудов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем наблюдать in vivo взаимодействия между циркулирующими клетками крови и сосудистым пониманием.

Подготовьте самца мыши к операции после семи дней ангиотензина два сеанса с осматической помпой согласно тексту протол. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы защитить их во время процедуры. Поместите животное под наркозом в лежачем положении на хирургическую пластину с температурой 39 градусов Цельсия и вставьте ректальный зонд для поддержания температуры.

С помощью ватного тампона распределите и втирайте крем для удаления волос в шею, пока волосы не начнут выпадать. Затем, еще через 2 минуты, с помощью шпателя удалите волоски и крем. Затем продезинфицируйте кожу с помощью спиртового антисептика для кожи.

Далее под стереомикроскопом сделайте продольный разрез от 1 до 1,5 см в коже шеи, в 1 см от трахеи. Затем сделайте 2 перпендикулярных разреза с каждого конца первого разреза. Осторожно удалите ткань прямо под кожей и удалите кусочек кожи, закрывающий левую яремную вену и трахею.

Далее с помощью двух изогнутых щипцов аккуратно изолируйте подъязычные и подчелюстные корродированные железы от зоны интереса. Стараясь не порезать и не повредить железы, расположите их так, чтобы обеспечить наилучший доступ к яремной вене и корридам. Затем, чтобы изолировать яремную вену, введите тонкие щипцы между сосудом и окружающими тканями, а затем медленно откройте и закройте инструмент, чтобы аккуратно освободить вену от тканей.

Как только яремная вена будет полностью чистой, расположите щипцы под сосудом и наложите под него два шва длиной 10 см 7-0. Завяжите два узла, чтобы закрыть шов проксимальнее головки и вторым швом подготовьте один узел, но не закрывайте его. Теперь, держа щипцами в одной руке, держите катетер, наполненный стерильным физиологическим раствором 37 градусов Цельсия, затем другой рукой с помощью ножниц или изогнутой иглы 26 калибра сделайте небольшой разрез в сосуде.

Введите катетер в яремную вену и закройте узел два раза. Затем закройте шов проксимальнее головки над катетером, чтобы обеспечить полную иммобилизацию. Чтобы изолировать и подготовить корродированные артерии, с помощью тонких изогнутых щипцов рассекают область, покрывающую трахею.

Затем, как только корродированные клетки освободятся от окружающих тканей, удалите вегасский нерв из сосуда, не разрезая его, медленно закрывая и открывая тонкие щипцы, если это необходимо, чтобы мягко мобилизовать нерв. Как только обе артерии полностью очистятся, поместите щипцы под первую корродированную артерию и, стараясь не перетянуть сосуд, поместите под сосуд небольшой черный пластиковый держатель для сосудов размером 3 мм на 2,5 см. После того, как держатель сосуда будет на месте, убедитесь в наличии кровотока.

Чтобы избежать растяжения сосуда, рука оператора должна двигаться как можно меньше одним движением первых щипцов для изоляции корродированной артерии и с помощью вторых щипцов для проделывания отверстия под сосудом. Когда держатель сосуда расположен правильно, поместите вторую артерию над устройством. Если мышь не помещена непосредственно под микроскоп, поместите железы обратно на трахею и примените стерильный физиологический раствор при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы избежать пересыхания зоны.

В шприце объемом 1 мл приготовьте 1-4 разведения в стерильном физрастворе 2 мг на мл талого стокового раствора акридина апельсина. Беречь шприц от света. Чтобы выполнить измерения, поместите мышь под высокоскоростной широкоугольный флуоресцентный микроскоп с использованием длинноудаленного конденсатора и 10-кратного водно-иммерсионного объектива с монохроматером, светоделителем и ПЗС-камерой.

Получайте изображения в режиме реального времени, фокусируя объектив в центре корродированной артерии на поверхности эндотелия. Медленно введите 50 мл апельсина акридина. Затем настройте программное обеспечение на запись 100 изображений с выдержкой 120 миллисекунд на каждый снимок.

Запишите четыре видео для каждой корродированной артерии в разных местах артерии для каждого видео. Если флуоресцентный сигнал снижается, введите еще 50 мл акридина апельсина. Чтобы проверить различные условия, введите оранжевый акридин непосредственно в боковую хвостовую вену, если яремный катетер не был вставлен, и проведите получение того же изображения.

В качестве контроля запишите измерения цветения у неинъекционных lys-Mcre-положительных, IRG-положительных мышей. Количественное определение ячеек качения и адгезии в прямоугольнике размером 200 на 250 микрон, расположенном в центре сосуда, для каждого видео, отображаемого со скоростью 10 изображений в секунду. Подсчитайте количество катящихся и адгезионных ячеек.

Адгезивные клетки определяются как клетки, которые не перемещаются и не отделяются от эндотелия в течение 10-секундного видео. Чтобы упростить количественное определение, удалите канал с красной флуоресценцией и используйте только зеленую флуоресценцию для подсчета вращающихся и адгезивных ячеек. В этом исследовании корродированные мыши, инфицированные lys-mCre, IRG-положительными мышами, которым вводили ангиотензин 2, наблюдались с помощью IVM.

Как видно на исходном уровне, наличие яремного катетера приводило к адгезии lys-M-положительных флуоресцентных клеток. После инъекции акридина апельсина эндотелиальные клетки также стали флуоресцентными. Затем, восстановив фон для ограничения эндотелиальной флуоресценции, показало, что все адгезивные клетки с ядром были lys-M-положительными.

В этом эксперименте, после одной недели инфузии ангиотензина-2, взаимодействия эндотелия лейкоцитов в корродированных артериях lys-M Cre-положительных IRG-положительных мышей были визуализированы и визуализированы с помощью IVM, с инъекцией апельсина акридина или без нее, через яремный катетер или через хвостовую вену. Без какого-либо катетера или инъекции перекатывание lys-M-положительных клеток значительно увеличивалось после инфузии ангиотензина 2 по сравнению с мышами, не получавшими лечения. И адгезия также была увеличена.

Инъекция акридина оранжевого цвета с яремным катетером усиливала адгезию и перекатывание ангиотензина 2 у мышей, в большей степени по сравнению с мышами без катетера. Наконец, как видно на этих панелях, инъекция акридина оранжевого в хвостовую вену приводит к аналогичной адгезии и перекатыванию по сравнению с мышами, которые не получали инъекцию акридина апельсина. После освоения этой техники ее можно выполнить за тридцать минут, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что нельзя повредить ткани, окружающие сосуды. После своего развития этот метод открывает путь исследователям в области сердечно-сосудистых заболеваний и гемостатиков к изучению адгезии лейкоцитов и тромбоцитов к сосудистой стенке in vivo. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как ограничить влияние инъекции красителя и хирургического вмешательства в IVM.

Не забывайте, что работа с интеркалирующими флуоресцентными красителями может быть чрезвычайно опасной, и необходимо избегать контакта кожи с красителем с помощью подходящего материала, такого как перчатки.