Выделение и характеристика нейтрофилов производные микрочастиц для функциональных исследований

Общая цель данного протокола заключается в выделении и описании микрочастиц, полученных из нейтрофилов, для проведения функциональных исследований. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о роли везикул экзоклеток, или микрочастиц, в межклеточной коммуникации в различных физиологических процессах, включая рак, воспаление и заживление ран. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он является относительно быстрым, экономически эффективным и позволяет оценить пхенотипический состав микрочастиц, или микровезикул, в функциональных активах.

Демонстрировать процедуру будут Ариэль Финкельштейн, научный сотрудник моей лаборатории, и Джозеф Ли, студент моей лаборатории. Для разделения по градиенту плотности полиморфноядерных клеток костного мозга мыши, или PMN, сначала медленно наносите три миллилитра свежеприготовленного раствора комнатной температуры, 1,077 грамма на миллилитр свежеприготовленного раствора комнатной температуры, 1,119 грамма на миллилитр плотности, в одну 15-миллилитровую коническую пробирку на образцы клеток костного мозга. Затем наложите один миллилитр свежевыделенных клеток костного мозга в ледяном PBS на верхний слой градиента плотности каждой пробирки и разделите клетки с помощью центрифугирования градиента плотности.

В конце разделения осторожно удалите слои мононуклеарных ячеек на границах между PBS и верхними слоями градиента плотности в каждой трубке, не нарушая полосы PMN. С помощью переводной пипетки соберите слои PMN в одну новую пробирку объемом 15 миллилитров на образец и доведите окончательный объем в каждой пробирке до 15 миллилитров с помощью фильтрованного PBS размером 0,1 микрона. Гранулируйте PMN центрифугированием с последующим вторым центрифугированием в двух миллилитрах свежеотфильтрованного PBS на пробирку.

Затем повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре свежеотфильтрованного PBS для подсчета. После подсчета снова центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте гранулу в 100 микроналиве 0,1 микрон фильтрованного HBSS, дополненного интересующим стимулятором на 10 миллионов клеток. Инкубируйте от 20 до 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

В конце стимуляции соберите клетки центрифугированием и перенесите бесклеточные надосадочные жидкости в одну новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллиметра на образец. Центрифугируйте надосадочную жидкость для удаления остатков клеток и перенесите очищенную надосадочную жидкость в новые ультрацентрифужные пробирки, затем ультрацентрифугируйте надосадочную жидкость и храните гранулированные микрочастицы в герметичных ультрацентрифужных пробирках при температуре 80 градусов Цельсия до дальнейшего экспериментального анализа. Чтобы ввести микрочастицы в толстую кишку мыши, сначала поместите полностью обезболенную мышь в положение лежа и используйте биопсийные щипцы и эндоскоп, оснащенный камерой высокого разрешения, чтобы создать от трех до пяти поверхностных ран вдоль дорсальной стороны толстой кишки.

Верните мышь в клетку с контролем до полного выздоровления. Через 24 часа используйте эндоскоп для получения изображений нанесенных ран под наркозом. Затем с помощью системы микроинъекций, основанной на колоноскопии, можно ввести экспериментальный объем микрочастиц PMN, повторно суспендированных в 100 микролитрах HBSS, непосредственно в каждое место раны.

Размерная гетерогенность микрочастиц PMN может быть оценена путем сравнения микрочастиц с гранулами проточной цитометрии известного размера. Как показано, экспрессия интересующих белков микрочастицами также может быть исследована с помощью проточной цитометрии. В этом эксперименте экспрессия ключевых воспалительных и противовоспалительных молекул микрочастицами, полученными из PMN, стимулированных активатором, оценивалась с помощью иммуноблоттинга.

Влияние микрочастиц PMN на заживление эпителиальных клеток можно контролировать путем получения изображений поврежденных царапинами монослоев эпителия в заранее определенные моменты времени in vitro, а также после ранения биопсийными щипцами in vivio. После освоения микрочастицы, полученные из PMN, могут быть выделены в течение четырех часов, если метод выполнен правильно. При проведении этой процедуры важно помнить, что перед стимуляцией PMN следует держать на льду, чтобы предотвратить преждевременную активацию и потерю микрочастиц.

После этой процедуры можно использовать методы проточной цитометрии, иммуноблоттинга и реакции пролиферации в реальном времени для определения содержания микрочастиц в различных стимулирующих условиях или из различных клеток происхождения. Этот метод полезен для изучения роли микрочастиц в регуляции иммунных реакций, барьерной функции, повреждении и восстановлении тканей, а также в прогрессировании рака. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделять и маркировать мышиные микрочастицы, а также использовать микрочастицы в качестве функционального ранозаживляющего средства in vivo.

Не забывайте, что работа с живыми животными может быть опасной, и что меры предосторожности предполагают надевание средств индивидуальной защиты и прохождение соответствующих инструктажей по технике безопасности перед выполнением этой процедуры.