В естественных условиях Одноместный молекула отслеживания на терминале Пресинаптический двигательного нерва дрозофилы

Отслеживание одной молекулы in vivo в пресинаптическом нервном окончании Drosophila. Этот метод описывает, как отдельные белки могут быть отслежены и визуализированы in vivo в окончаниях двигательных нервов личинок дрозофилы третьего возраста. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет визуализировать, отслеживать и локализовать отдельные белки с высоким разрешением, аналогичным тому, которое наблюдается в системах in vitro.

Дизайн трансгенной дрозофилы. Интересующий нас синаптический белок помечен фотоконвертируемым флуорофором, и он экспрессируется у Drosophila melanogaster. Вскрытие личинки дрозофилы третьего возраста.

Поместите блуждающую личинку третьего возраста на цилиндрическую или полуцилиндрическую форму основания Sylgard. Добавьте 40 микролитров Schneider's Insect Medium на личинку. Под препарирующим микроскопом воткните крошечную булавку через голову и еще одну через хвост личинки, чтобы обездвижить ее.

Чтобы обеспечить доступ, используйте крошечную булавку, чтобы сделать узкий разрез по средней линии дорсальной стороны брюшной области личинки. Из этой точки разреза с помощью пружинных ножниц разрежьте вдоль стенки тела в переднем заднем направлении. Удалите внутренние органы личинки с помощью тонких щипцов и пружинных ножниц.

Промойте рассеченную личинку средством для насекомых от Schneider. Воткните по два мельчайших булавка в каждую из двух створок стенки корпуса, чтобы получить препарированный личиночный препарат в форме шестиугольника. Используйте пружинные ножницы, чтобы отделить мозг личинки от вентрального нервного канатика.

С помощью изогнутого пинцета вдавите мельчайшие булавки в основание Sylgard. Микроскопия локализации с отслеживанием отдельных частиц с фотоактивацией. Переверните основание Sylgard личинки на чашку для культуры со стеклянным дном, наполненную двумя миллилитрами среды для насекомых Schneider's Insect Medium комнатной температуры.

Нанесите воду на объектив с 63-кратным погружением в воду микроскопа ELYRA PS.1, а затем поставьте чашку на сцену. Включите проходящий свет и с помощью окуляра определите местонахождение личинки на базе Сильгарда с помощью 10-кратного воздушного объектива. Переключитесь на объектив 63-кратного погружения в воду и определите шестую мышцу с помощью яркого освещения поля.

С помощью программного обеспечения ZEN Black Acquisition Software выберите конфигурацию Total Internal Reflection Fluorescence, TIRF. Переключите 488-нанометровый лазер, чтобы визуализировать eMos2 зеленым цветом. Найдите нервно-мышечные соединения, которые выглядят как бусины на нитке, и получите изображение TIRF с низким разрешением, одновременно включите 405-нанометровый лазер и 561-нанометровый лазер, чтобы фотопреобразовать и получить изображение красных частиц eMos2.

Используйте очень низкую мощность лазера для 405-нанометрового лазера, чтобы обеспечить умеренно постоянные стохастические фотопревращения. Здесь 405-нанометровый лазер работает на 0,09%, в то время как 561-нанометровый лазер работает на 50%. Установите время экспозиции на 30 миллисекунд.

Получение временных рядов изображений нервно-мышечного соединения. Здесь был приобретен фильм на 15 000 кадров. Сохраните фильм в формате czi.

анализ данных. Анализируйте полученные видеоролики с помощью подходящего аналитического программного обеспечения для слежения за одной молекулой. Найдите координаты x и y каждой локализации флуоресцентного белка с помощью гауссова аппроксимации функции распределения точки интенсивности.

Чтобы проследить траекторию каждой локализации, установите пороговое значение, равное не менее восьми непрерывным различным появлениям кадров для каждой локализации и не более трех пиксельных перемещений между каждым кадром. Получите изображение траектории, среднее квадратичное смещение, а также коэффициент диффузии всех отслеживаемых локализаций. Репрезентативные результаты.

Построено среднеквадратичное смещение отдельных траекторий Syntaxin-1A-eMos2 от множественных нервно-мышечных соединений у трех различных личинок в виде среднего плюс минус стандартная ошибка среднего. Также была построена площадь под кривой среднего квадратичного смещения. Коэффициент диффузии синтаксина-1A-mEos2 был аналогичным образом получен из множественных нервно-мышечных соединений и построен в виде гистограммы распределения относительной частоты.

Пороговое значение коэффициента диффузии выявило две популяции синтаксина-1А: мобильную и неподвижную популяцию. Было рассчитано соотношение мобильных и неподвижных популяций синтаксина-1A-mEos2. Заключение. Это видео должно дать представление о том, как может быть проведено отслеживание одного белка в нервно-мышечном соединении личинок дрозофилы.

Этот метод позволяет исследователям в области нейронной коммуникации визуализировать и наблюдать за подвижностью и организацией отдельных белков с высоким разрешением in vivo.