Сочетая рентгеноструктурного анализа с малоуглового рентгеновского рассеяния для моделирования неструктурированных регионов Nsa1 от S. Cerevisiae

Общая цель этой процедуры заключается в получении рекомбинантного белка, состоящего из смеси упорядоченных и неупорядоченных доменов, для гибридного структурного анализа с помощью как рентгеновской кристаллографии, так и малоуглового рентгеновского рассеяния. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы структурной биологии о размещении биологической функции таким образом, чтобы при определении всех растворов оставалась структура белка. Основное преимущество этого метода заключается в том, что его можно использовать для моделирования динамических областей белка или макромолекулы, которые не могут быть разрешены с помощью рентгеновской кристаллографии.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, поначалу будут испытывать трудности с изучением того, как правильно оценивать качество своих данных SAXS. Чтобы начать процедуру, трансформируйте экспрессирующую Nsa1 плазмиду в подходящий экспрессионный штамм E.coli. Культивируйте клетки, индуцируйте экспрессию Nsa1 и собирайте клетки.

Ресуспендируйте клетки в 25 миллилитрах буфера для лизиса, предварительно охладите до четырех градусов Цельсия, содержащем одну таблетку ингибитора протеазы, не содержащую ЭДТА. Обрабатывайте клетки ультразвуком при температуре четыре градуса Цельсия в течение семи минут, с циклом две секунды включения, две секунды выключения. Затем центрифугируйте лизат при температуре 26, 900 кратной гравитации в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия.

Следите за тем, чтобы смесь не замерзла во время центрифугирования. Затем уравновесьте колонну гравитационного потока, содержащую 10 мл иммобилизованной смолы сродства кобальта с буфером для лизиса. Загрузите осветленный лизат на колонку и дайте ему протечь через смолу при температуре четыре градуса Цельсия.

Затем дважды промойте смолу порциями 100 мл буфера для лизиса. Выведите Nsa1 из колонки с 20мл элюирующего буфера. Нанесите аликвоту 15 мкл элуэра на гель от 4 до 15% SDS-PAGE, чтобы подтвердить элюирование белка.

Затем добавьте 1 мл 1 мг/мл исходного раствора протеазы TEV в элуэр. Инкубируйте элуэр при четырех градусах Цельсия в течение ночи, чтобы удалить метку MBP. Затем используйте центробежный фильтр мощностью 10 килодальтон для концентрирования расщепленного MBP Nsa1 примерно до 5 мл, стараясь не допустить чрезмерной концентрации.

Очистите концентрированный белок на гелевой фильтрующей колонке, предварительно уравновешенной буфером А. Одним из важнейших этапов этой процедуры является удаление всех агрегатов во время очистки. Агрегаты будут мешать кристаллизации, сбору и анализу данных SAXS. Проанализируйте образцы 15 мкл из каждой фракции колонки с помощью SDS-PAGE, чтобы подтвердить отделение ПМБ от Nsa1.

Соедините Nsa1, содержащий дроби. Используйте центробежный фильтр мощностью 10 килодальтон для концентрирования объединенных фракций примерно до 8 мг/мл. Измерьте поглощение на 289 нанометрах и рассчитайте концентрацию белка.

Немедленно приступайте к протеолитическому скринингу и испытаниям кристаллизации. Чтобы начать протеолитический скрининг, приготовьте 1 мг/мл стоковых растворов альфа-комотрипсина, трипсина, эластазы, капайина, септилизина и эндопротеиназы GluC. Разбавьте каждый стоковый раствор разбавляющим буфером до 1:10, 1:100 и 1:1 000.

Разбавьте раствор Nsa1 с 8 мг/мл до 1 мг/мл с буфером А. Затем для каждого разведения протеазы соедините 1 мкл разведенной протеазы с 9 мкл разбавленного белкового запаса. Инкубируйте растворы при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем добавьте 10 мкл 2x SDS-PAGE образца в буфер к каждому раствору и нагрейте растворы до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Запустите растворы на геле от 4 до 15% SDS-PAGE, чтобы определить устойчивые к протеазе домены. Создание усеченных конструкций выражений, исключающих лабильные области протеазы. Экспрессируйте и очищайте эти белки для оптимизации кристаллизации.

После получения данных SAXS для белка Nsa1 в диапазоне концентраций установите путь к файлу оболочки терминала к каталогу, содержащему данные. Затем запустите программное обеспечение для анализа. Загрузите кривые рассеяния в программное обеспечение для анализа.

Используйте инструмент auto RG для определения радиуса вращения и интенсивности прямого рассеяния для каждой кривой. Затем сгенерируйте графики Кратки для каждой кривой рассеяния, чтобы определить степень компактности. Используйте инструмент autonome для вычисления функции попарного распределения для каждой кривой, используя начальный максимальный размер, равный 3x радиусу вращения.

Оптимизируйте максимальную размерность, чтобы получить гладкую кривую функции попарного распределения, которая согласуется с экспериментальной кривой рассеяния. Сравните структурные параметры при разных концентрациях, чтобы убедиться в отсутствии радиационных повреждений или эффектов, зависящих от концентрации. Крайне важно сравнить ключевые структурные параметры, включая радиус вращения, молекулярную массу, функции прямого рассеяния и распределения расстояния между парами в ряду концентраций.

И это необходимо для того, чтобы гарантировать отсутствие радиационного повреждения или эффектов концентрации. Затем запустите утилиту метода оптимизации ансамбля, используя исходный файл кристаллической структуры белка, файл последовательности целевого белка и экспериментальный файл данных SAXS. Сравните значения хи-квадрат из исходного файла кристаллической структуры с файлом ансамбля, чтобы определить, хорошо ли модель ансамбля соответствует экспериментальным данным.

Используйте программное обеспечение для молекулярной визуализации, чтобы наложить кристаллическую структуру на сгенерированные конформеры. Обратите внимание на общее количество конформеров и долю занятости для каждого конформера, участвующего в кривой рассеяния. Протеолитическое расщепление лабильной протеазы C конца Nsa1 приводило к образованию орторомбических кристаллов.

Свежеочищенный Nsa1 образовывал кубические кристаллы, но кристаллической структуре все еще не хватало электронной плотности для лабильного c конца. N-концевой семь бленых бета-пропеллеров WD-40 домена Nsa1 был хорошо разрешен в обеих структурах. Домен Nsa1 WD-40 сам по себе не очень хорошо подходит для экспериментальных данных SAXS.

Комбинация моделирования твердого тела и первоначальной реконструкции С-конечной точки значительно улучшила хорошую посадку. Моделирование ансамбля обеспечило еще большее улучшение прилегания, выявив подтверждающую выборку С-концевого хвоста в растворе. Несмотря на то, что SAXS является структурным методом с низким разрешением, он очень хорошо дополняет структурные исследования с высоким разрешением, такие как рентгеновская кристаллография.

Таким образом, вы можете моделировать гибкие и неупорядоченные области. Собирая и анализируя данные SAXS о макромолекулах, вы можете начать понимать подтверждающие изменения, которые произошли после просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее представление о том, как решить структуру белка, состоящего из упорядоченных и неупорядоченных областей, с помощью как рентгеновской кристаллографии, так и SAXS.