Рентгенофлуоресцентного капиллярного электрофореза масс-спектрометрии для метаболомики одноклеточных в жить лягушки (Xenopus laevis) эмбрионов

Общая цель этого протокола заключается в характеристике метаболитов в живых клетках развивающихся эмбрионов с помощью микросэмплинга капиллярного электрофореза-масс-спектрометрии in situ. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии и биологии развития, поскольку он позволяет анализировать метаболизм в отдельных клетках непосредственно в живых развивающихся эмбрионах. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он быстрый, масштабируемый на различные размеры клеток и позволяет проводить минимально инвазивный отбор проб отдельных клеток у живых эмбрионов.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как некоторые шаги трудно освоить, потому что эмбрион развивается относительно быстро, и используется специально изготовленный прибор для ионизации электроспреем с капиллярным электрофорезом. Начните эту процедуру с приготовления 2%-ной агарозы в одном растворе 1Х Штейнберга. Пока еще жидкость, смажьте раствором дно 60-миллиметровых чашек Петри.

Как только агарозный гель остынет и затвердеет, обжарьте конец шестидюймовой пипетки Пастера, пока она не образует шар. Затем слегка прикоснитесь к нагретому концу, чтобы впечатать от пяти до 10 лунок примерно на один миллиметр вглубь агарозы. Чтобы изготовить микропипетки с коническим коническим концом, сначала вытяните боросиликатные капилляры в капиллярном пуллере типа Flaming/Brown, используя настройки, найденные в текстовом протоколе.

Затем отломайте кончик вытянутой микропипетки с помощью пары тонких острых щипцов, чтобы получить внешний диаметр капиллярного кончика примерно 20 микрон. Выполните этот шаг под стереомикроскопом для повышения точности и воспроизводимости. Получение эмбрионов путем естественного спаривания взрослых особей xenopus laevis с помощью гонадотропина или путем экстракорпорального оплодотворения, как указано в текстовом протоколе.

Удалите желейную оболочку, окружающую эмбрионы, когда они начнут расщепляться в двухклеточную стадию, сначала дав эмбрионам отдохнуть в растворе для желирования в течение двух минут. Затем осторожно поворачивайте их еще две минуты, чтобы предотвратить прилипание эмбрионов к поверхности чашки для сбора. Аккуратно вылейте содержимое посуды в чистую мензурку и быстро сцедите раствор для желе из стакана.

Немедленно залейте яйца 0,1-кратным раствором Штейнберга, чтобы смыть оставшийся раствор для дежелирования. Аккуратно взболтайте, а затем сцедите раствор. Повторите этот шаг четыре раза, чтобы тщательно промыть зародыши.

Перенесите желированные эмбрионы в раствор 1X Steinberg's в чашке Петри. Чтобы свести к минимуму скученность внутри тарелок, поместите примерно 100 эмбрионов на 100-миллиметровую тарелку. Отсортируйте расщепляющиеся эмбрионы на двухклеточной стадии в отдельную чашку, в которой стереотипная пигментация уверенно отмечает дорсальный вентральный доступ с привязкой к установлению сульфатных карт.

Правильно определите расщепляющиеся эмбрионы, убедившись, что первая борозда спайности, обозначающая среднюю сагиттальную плоскость, делит пополам темное и слабо пигментированное животное таким образом, что две половины являются зеркальным отражением. Затем установите изготовленную микропипетку на многоосевой микроманипулятор. Подключите микропипетку к микроинъектору.

С помощью пластиковой переносной пипетки отсадите примерно пять из восьмиклеточных эмбрионов и перенесите их в чашку для отбора проб, содержащую 0,5-кратный раствор Штейнберга. С помощью петли для волос поместите эмбрион, подлежащий отбору проб, в отдельную лунку и убедитесь, что правильно идентифицированная исследуемая клетка обращена к микрозонду под углом примерно 90 градусов. Работая под стереомикроскопом, направляйте кончик микропипетки в идентифицированную одиночную клетку живого эмбриона.

Извлеките желаемую порцию содержимого клетки, подавая импульсы отрицательного давления на микрокапилляр с помощью микроинжектора. Аккуратно втяните микрозонд из клетки и перенесите его наконечник в четыре микролитра растворителя для экстракции метаболитов, охлажденного в микроразмерном флаконе. Затем подайте скачок давления с положительным давлением 80 фунтов на квадратный дюйм в течение одной секунды к капилляру с помощью микроинжектора, чтобы вытолкнуть аспират в растворитель.

Плотно закройте флакон, чтобы предотвратить испарение, и положите флакон обратно на лед до завершения отбора проб. После завершения отбора проб вихревое перемешивание образца, содержащего микроцентрифужные флаконы, в течение примерно одной минуты для ускорения экстракции метаболитов. Затем центрифугируйте флаконы при 8 000 мг g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы измельчить клеточный мусор и другие частицы.

Храните клеточные экстракты вместе с остатками клеток и выпадайте в осадок при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение суток или при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение одного месяца до измерения с помощью CE-ESI-МС. Сконструируйте платформу для впрыска CE, способную быстро перемещать по вертикали столик с флаконом с фоновым электролитом и микрофлакон для загрузки образца, как указано в текстовом протоколе. Соберите интерфейс CE-ESI, сначала установив металлический излучатель электронапыления в трехпортовый Т-образный штуцер.

Затем подайте разделительный капилляр CE через излучатель электрораспыления, позволяя ему выступать примерно на 40–100 микрон за пределы кончика излучателя. Работайте под стереомикроскопом для повышения точности. Подсоедините капилляр листового раствора к оставшемуся порту для подачи раствора электроспрея.

Используйте соответствующие втулки и затянутые пальцами соединения для работы интерфейса CE-ESI без утечек. С помощью держателя пластин установите интерфейс CE-ESI на трехосевой столик для трансляции и расположите наконечник излучателя электроспрея примерно в двух миллиметрах от отверстия масс-спектрометра. Для очистки компонентов интерфейса сначала подайте листовой раствор электрораспыления через эмиттер электрораспыления со скоростью один микролитр в минуту, а BGE — через капилляр разделения CE.

Используйте шприцевые насосы для подачи растворителей с постоянной скоростью. Затем промывайте разделительный капилляр CE перед каждым измерением, подсоединив шприц к входному концу капилляра. Эффективно используйте шприцы большого размера, чтобы свести к минимуму повторное наполнение и заправку линий подачи растворителей.

Промыв разделительный капилляр в течение примерно пяти минут, перенесите его вход в раствор BGE, расположенный в флаконе из нержавеющей стали. Расположите наконечник излучателя электрораспыления примерно в двух миллиметрах от отверстия масс-спектрометра. Точная регулировка этого расстояния с помощью трансляционного столика для генерации электрораспыления в режиме стабильной конусной струи при одновременном наблюдении за распылением с помощью стереомикроскопа.

Контролируйте стабильность общего ионного тока или TIC в течение примерно 30–45 минут, чтобы обеспечить стабильную работу. Подайте напряжение 21 плюс-минус два киловольта на флакон BGE, постепенно увеличивая потенциал в течение примерно 15 секунд, обычно генерируя около 7,5 микроампер тока через разделительный капилляр с использованием 1%-ного процента муравьиной кислоты в качестве BGE. Перед каждым измерением обеспечьте стабильность системы, контролируя профиль TIC в течение примерно 5–10 минут, а затем ступенчато снижайте потенциал разделения до нуля вольт.

Налейте пипеткой один микролитр стандартного охлаждающего раствора ацетила во флакон для инъекций и перенесите разделительный капилляр из флакона BGE во флакон для инъекций. Поднимите ступень для впрыска CE на 15 сантиметров за одну секунду. Через 60 секунд гидродинамически введите шесть нанолитров образца в разделительный капилляр.

Затем переместите ступень обратно в исходное положение и аккуратно переместите входной конец капилляра в BGE. Сразу после этого увеличьте напряжение CE, чтобы начать электрофоретическое разделение и регистрацию состояния EMA. После обнаружения стандарта остановите сбор данных и ступенчато понизьте напряжение разделения до нуля вольт.

Затем извлеките излучатель на расстояние двух сантиметров от отверстия. Промойте разделительный капилляр в течение пяти минут перед анализом клеточного экстракта. Измерьте 10 нанолитров экстракта одной клетки, повторив эти шаги, используя 90 секунд для гидродинамического введения образца.

Здесь показана репрезентативная электроферограмма клеточного экстракта, на которой показано разделение ряда идентифицированных метаболитов. 70 различных сигналов были идентифицированы с высокой степенью достоверности как малые полярные метаболиты на основе времени миграции и паттернов фрагментации МС/МС сигналов клеточного экстракта по сравнению со стандартными или тандемными масс-спектральными библиотеками. Идентификация метаболитов проводится путем сравнения точной массы, времени миграции и поведения фрагментации неизвестного сигнала из образца со стандартом метаболитов или данными, доступными в базе данных метаболитов.

Этот шаг продемонстрирован для гистидина. Здесь показаны отдельные дорсальные клетки, которые были идентифицированы и отобраны с помощью микрозонда CE-ESI-MS, на восьмиклеточном, 16-клеточном и 32-клеточном эмбриональных стадиях. Многофакторный анализ идентифицированных метаболитов в трех различных типах клеток выявил различные метаболические профили и сложные метаболические тренды на разных клеточных стадиях.

Анализ количественных метаданных с помощью главных компонент выявил метаболические изменения, когда идентифицированная прогениторная клетка восьмиклеточного эмбриона была разделена с образованием клеточного клона в 16-клеточном и 32-клеточном эмбрионе. Для отдельных метаболитов показаны репрезентативные тенденции. Метаболиты, такие как ацетилхолин, уменьшались в изобилии с делением клеток, в то время как троламин и серин/аргинин показали противоположные тенденции в этих типах клеток.

После освоения эта техника может быть выполнена очень быстро, обычно менее чем за 10 секунд для каждой клетки. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы начали картирование метаболической гетерогенности клеток в раннем эмбрионе xenopus laevis. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать микрозондовый капиллярный электрофорез-масс-спектрометрию для анализа метаболитов в одиночных эмбриональных клетках.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что нужно работать быстро, так как метаболом динамичен и клетки развивающегося эмбриона быстро делятся. Кроме того, изучите аналитические детали, чтобы убедиться, что собраны данные высокого качества о клеточном метаболизме. Применение этого метода распространяется и на диагностику живых образцов, потому что наш подход к масс-спектрометрии с микрозондами работает быстро, минимально инвазивно и совместим с небольшими образцами.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как отслеживание сульфатов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как влияние метаболитов на спецификацию тканей. Не забывайте, что работа с высоковольтными источниками питания может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как электрическая изоляция электрифицированных интерфейсов.