Автоматизированное измерение криптококковой видов полисахаридной капсулы и клетки тела

Общая цель этого метода — автоматизировать утомительные ручные измерения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области криптококковой инфекции, такие как взаимосвязь между размером капсулы или клеточного тела, а также различные аспекты вирулентности. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет анализировать огромные объемы образцов без усталости.

Применение этого метода распространяется и на терапию криптококкоза, потому что размер капсулы и клеточного тела являются важными аспектами патогена. Чтобы приготовить предметное стекло индийскими чернилами, начните с пипетирования 10 микролитров образца криптококковой инфекции на предметное стекло. Любой круговой штамм yi работал, но для этого эксперимента использовался только H99.

Нанесите пипеткой два микролитра красителя индийских чернил на образец и перемешайте его, физически вдавливая наконечник пипетки в образец и двигая круговыми движениями до тех пор, пока индийские чернила не станут равномерно распределенными. Наденьте защитное стекло на образец, удерживая левый край защитного стекла у поверхности предметного стекла. Затем аккуратно и равномерно опустите противоположную сторону крышки на образец.

Дайте предметному стеклу высохнуть на воздухе в течение пяти минут. Затем нанесите легкий слой лака для ногтей на покровную границу, чтобы образовать уплотнение и сохранить пятно от индийских чернил. Чтобы получить изображение образцов, поместите предметное стекло под светлопольный микроскоп с насадкой для камеры и известным преобразованием пикселей в микроны.

Отрегулируйте фильтры, объективы и контрасты, а также убедитесь, что поле зрения плотное, но не перенаселенное, криптококковыми клетками с четким контрастом между капсулой клетки и фоном, и правильно сфокусировано с телом клетки, визуализированным в виде темной полосы. После съемки изображений сохраните их в одном каталоге с понятными заголовками, так как алгоритм измерения будет запущен на изображениях в одном каталоге, а выходные данные будут организованы в соответствии с именами файлов изображений. Проследив за настройкой алгоритма по текстовому протоколу, запустите приложение, дважды кликнув по QCA.py.

Выполняя описанные в программе шаги, введите тип расширения файлов изображений, которому предшествует точка и который разделяется точкой с запятой. Затем нажмите кнопку Enter. Выберите директорию, в которой находятся файлы изображений, нажав кнопку «Выбрать директорию», и выберите папку, в которой находятся изображения.

Сгенерируйте список файлов изображений в каталоге, нажав кнопку «Создать список образов». Изображения будут перечислены в текстовом поле справа. Проверьте и убедитесь, что список точен и полон.

Затем выберите случайное изображение из списка для предварительного просмотра, нажав кнопку «Выбрать случайное изображение». Затем введите объектив микроскопа и настройки группирования. Если настройки по умолчанию не соответствуют используемому микроскопу, выберите «Пользовательское преобразование пикселей» и введите преобразование пикселей в микрометры для файлов изображений.

После выбора нажмите кнопку «Вычислить преобразование» и убедитесь, что преобразование верно в соответствии с текстовым полем справа. Чтобы ввести параметры алгоритма для обнаружения окружности, введите минимальный и максимальный радиусы, обнаруживаемые для обнаружения внешней капсулы, в виде записей минимального и максимального радиуса капсулы. Затем введите минимальный и максимальный радиусы, обнаруживаемые для обнаружения тела клетки, в качестве записей минимального и максимального радиуса тела клетки.

Теперь переместите ползунки чувствительности капсулы и клеточного тела, чтобы настроить порог чувствительности алгоритма. Низкая чувствительность будет строгой и уменьшит обнаружение ложноположительных кругов, но также может обнаружить меньшее количество реальных кругов. И наоборот, высокая чувствительность увеличивает скорость обнаружения, но также может привести к появлению ложноположительных кругов.

Увеличьте количество обнаруженных тел и капсул и визуально проверьте, правильно ли подходят круги. Количество тел в обнаруженных капсулах будет отображаться в текстовом поле справа. В противном случае манипулируйте параметрами алгоритма до тех пор, пока результаты не станут точными.

Запустите алгоритм обнаружения для всего каталога файлов изображений, нажав кнопку «Начать анализ». Каждое изображение будет проанализировано, и программа отобразит Finished в текстовом поле справа, когда все изображения будут проанализированы. Затем нажмите кнопку «Сопоставить и очистить».

Это позволит сопоставить обнаруженные клеточные тела с обнаруженными капсулами, в которых они находятся, и рассчитать истинный радиус капсулы путем вычитания тела из капсулы. В каталоге изображений найдите завершенные данные в файле CleanedOutput. CSV.

Если был выбран только один фрагмент данных, файл будет помечен как CleanedBodies. csv или CleanedCapsules.csv. Как видно на этом микроскопическом изображении предметного стекла индийскими чернилами, клетки разделены и имеют достаточно низкую плотность, чтобы не перегружать поле зрения.

Также было использовано достаточное количество морилки для создания контраста между клетками и фоном. Алгоритм определяет пороговое значение, уникальное для каждого изображения, беря среднее значение интенсивности и добавляя стандартное отклонение. Интенсивность пикселей с интенсивностью выше порога считается белой, а с более низкой интенсивностью — черной.

Тело клетки должно быть визуализировано в виде прочного черного круга на белом фоне капсулы. Лучше всего использовать фокальную плоскость, в которой тело клетки выглядит как темная, концентрированная полоса. Эта фокальная плоскость приемлема в качестве стандартной, потому что она правильно фокусирует клетку.

Это подтверждается визуализацией клеточной стенки с помощью UVITEX, своего рода красителя, который явно представляет собой четкую, сфокусированную клеточную стенку со слабым сигналом в центре. При точном следовании протоколу и получении оптимальных изображений алгоритм получается точным и надежным. Однако, если протокол соблюдается неправильно и из-за плохого окрашивания, скученности или других ранее упомянутых параметров получаются неоптимальные изображения, алгоритм теряет точность и не может повторить человеческие измерения.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за 10 минут при правильном выполнении. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно заранее получить представление о получении оптимальных изображений, чтобы быть готовым к получению реальных образцов. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области криптококковых исследований для изучения размеров капсул и клеток в любой системе визуализации, в которой они четко визуализируются.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерять криптококковые капсулы и клеточные тела. Не забывайте, что работа с криптококком может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как базовая безопасность BSL2.