Реальном времени измерения проницаемости эпителиальных барьер в человека кишечные Organoids

Общая цель этой процедуры заключается в измерении проницаемости эпителиального барьера в органоидах кишечника человека с течением времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гастроэнтерологии, например, как конкретные токсины, бактериальные продукты или даже фармакологические методы лечения могут изменить проницаемость эпителиального барьера. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет как визуализировать, так и количественно измерять проницаемость эпителиального барьера в режиме реального времени и с использованием эпителиальной ткани кишечника человека.

Перед микроинъекцией кишечных органоидов человека микроинъектор должен быть настроен, а микрокапилляр подготовлен, установлен и протестирован в соответствии с текстовым протоколом. Чтобы заполнить микрокапилляр материалом для инъекций, погрузите кончик стеклянного микрокапилляра в инъекционную суспензию FITC-декстрана, стараясь не сломать кончик микрокапилляра о боковую сторону или дно трубки. Потяните назад на шприц с минеральным маслом, чтобы набрать примерно 10 микролитров суспензии FITC-декстрана в микрокапилляр.

Когда микроинъекционная суспензия заполнит 90% длины стеклянного микрокапилляра, следует прекратить заполнение микрокапилляра. Слегка надавите на шприц перед тем, как извлечь микрокапилляр из раствора для микроинъекций, чтобы убедиться, что кончик микрокапилляра не содержит карманов воздуха. Извлеките планшет для культуры органоидов кишечника человека из инкубатора для клеточных культур и перенесите в бокс биологической безопасности с микроинъектором.

Снимите крышку с планшета для культивирования и отцентрируйте первую лунку на предметном столике микроскопа так, чтобы она была хорошо видна через окуляр эндоскопа при минимальной настройке увеличения. Поверните руку микроманипулятора таким образом, чтобы микрокапилляр был направлен вниз в культуральную лунку под углом более 45 градусов относительно предметного столика микроскопа. Расположите кончик микрокапилляра над первой культурой лунки примерно на один сантиметр над поверхностью среды.

Убедитесь, что через окуляр виден как кончик стеклянной нити, так и органоид кишечника человека. Ключом к успешной микроинъекции является тщательное выравнивание микрокапилляра с органоидом перед попыткой микроинъекции. И я всегда рекомендую новым пользователям потренироваться с запасной тканью, прежде чем они попытаются провести критический эксперимент.

Поворачивая ручку управления осью Z по часовой стрелке, медленно продвигайте микрокапилляр. Проткните органоид кишечника человека микрокапиллярным кончиком. Внешняя поверхность кишечного органоида человека будет немного надавливать, когда микрокапилляр начнет оказывать давление, и вернется в форму, когда кончик проникнет в просвет.

Если кончик микрокапилляра плохо виден в просвете, отрегулируйте освещение или настройки увеличения препарирующего микроскопа. Когда микрокапилляр правильно расположен кончиком микрокапилляра вблизи центра кишечного органоида человека, уберите руки с органов управления микроманипулятором. Слегка нажмите на шприц, наполненный минеральным маслом, чтобы вытолкнуть раствор для микроинъекций из микрокапилляра в просвет органоида кишечника человека.

Органоид кишечника человека может немного расширяться, чтобы вместить объем инъекции. Расположив микрокапилляр над средой, чтобы избежать случайного повреждения кишечных органоидов человека во время маневрирования, переместитесь к следующей мишени кишечного органоида человека. Между процедурами или в случае поломки замените микрокапилляры.

Ослабьте зажим на конце рычага микроманипулятора и извлеките микрокапилляр из держателя микропипетки. Для тестирования соединений, доставляемых в апикальный эпителий, соединение должно быть повторно суспендировано в стерильном PBS, содержащем два миллиграмма на миллилитр FITC-декстрана. В этом репрезентативном эксперименте повторно суспендировали токсин Clostridium difficile TcdA, добавили 12,8 нанограммов на микролитр в PBS, содержащую FITC-декстран, перед микроинъекцией.

Микровведение соединения в просвет органоида кишечника человека, как показано в предыдущем разделе. Для тестирования соединений, доставляемых в базальный латеральный компартмент, после микроинъекции FITC-декстрана заменяют наружные питательные среды новыми средами, содержащими два миллимоляра EGTA в качестве положительного контроля, только носитель PBS в качестве отрицательного контроля или другое экспериментальное соединение. Начните визуализацию в реальном времени сразу после микроинъекции.

На этом репрезентативном ярком изображении показан органоид кишечника человека, полученный из ткани, после микроинъекции FITC-декстрана. Флуоресцентный сигнал проявляется даже без использования специального набора фильтров. Органоиды кишечника человека, полученные из стволовых клеток, вводили микроинъекции четырехкилодальтонного конъюгированного декстрана FITC, суспендированного в PBS, или PBS, содержащего токсин Clostridium difficile TcdA.

В качестве положительного контроля ЭГТА добавляли в питательные среды кишечного кишечника человека в подгруппе кишечных органоидов человека, которым вводили PBS и FITC-декстран. Кишечные органоиды человека визуализировались в течение 20 часов. Как видно на этих изображениях, кишечные органоиды человека, введенные с помощью PBS, сохранили почти весь флуоресцентный сигнал, присутствующий при нулевом T.

Тем не менее, кишечные органоиды человека, которым также вводили TcdA или лечили EGTA, продемонстрировали существенное снижение интенсивности флуоресценции через восемь часов после микроинъекции. Данные визуализации были количественно оценены для всех кишечных органоидов человека во все моменты времени для получения набора данных с высоким разрешением, представляющего относительное изменение интенсивности флуоресценции с течением времени в каждом экспериментальном состоянии. После освоения эта техника может быть выполнена примерно за 30 минут или одного часа, в зависимости от количества экспериментальных условий.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о запасе терпения и не торопиться при выравнивании органоидов кишечника человека с микрокапиллярами перед микроинъекцией. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ПЦР, вестерн-блот и поиск РНК, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся реакции кишечного органоида человека на вводимый материал. Разработка этой методики позволила изучить влияние бактериальных токсинов, фармакологических агентов, цитокинов и даже живых микроорганизмов на эпителиальный барьер в кишечных органоидах человека.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как вводить флуоресцентно меченный декстран и другие экспериментальные материалы в просвет органоида кишечника человека. Не забывайте, что при работе с бактериальными токсинами или живыми организмами это может быть чрезвычайно опасно, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующих СИЗ. И, наконец, будьте особенно осторожны, чтобы избежать колотых ран, так как микрокапилляры очень острые.