Клональный анализ прекурсоров эмбриональных гемопоэтических стволовых клеток с использованием индекса одну ячейку Сортировка в сочетании с эндотелиальных клеток нишу Сопредседатель культуры

Общая цель этого метода заключается в определении фенотипических свойств и потенциала приживления клональных гемопоэтических стволовых клеток или предшественников ГСК во время эмбрионального развития мышей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гемопоэза развития об уникальном вкладе клональных предшественников ГСК в эмбриональное развитие. Основное преимущество этой методики заключается в том, что гемогенные предшественники анализируются на уровне отдельных клеток.

Это позволяет идентифицировать уникальные фенотипические свойства, которые отличают редкие предшественники ГСК. Начните с добавления Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM, тканей, рассеченных из эмбрионов между 9,5 и 11,5 днями после коитума, в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую 10 миллилитров PBS с добавлением 10% FBS на льду. Когда ткани осядут на дно пробирки, аспирируйте надосадочную жидкость и сразу же добавьте в образцы один миллилитр 0,25%-ной коллагеназы.

Через 25 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия остановите реакцию с помощью одного миллилитра PBS плюс FBS и используйте наконечник пипетки объемом в один миллилитр для растирания тканей от 20 до 30 раз до получения одноклеточной суспензии. Затем разбавьте клетки еще восемью миллилитрами PBS плюс FBS и соберите клетки центрифугированием. Повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах блокирующего буфера на пять минут на льду.

Затем добавьте 500 микролитров интересующего коктейля антител. После 15-20-минутной инкубации на льду промойте клетки в восьми миллилитрах PBS плюс FBS и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре свежего PBS плюс FBS. Отфильтруйте клетки через сетчатый фильтр 35 микрометров в пятимиллилитровую пробирку, промыв сетчатый фильтр еще тремя миллилитрами PBS плюс FBS, чтобы собрать все клетки и снова центрифугировать клетки.

Затем повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах PBS плюс FBS и поместите клетки на лед. Чтобы установить затворы для сортировки в режиме сортировки по одному клетку и индексной сортировки, загрузите небольшую аликвоту клеток на проточный цитометр и установите сбор на наименьшую скорость потока. Откройте график прямой области рассеяния и боковой области рассеяния и установите вентиль, чтобы включить ячейки разного размера.

Откройте график зависимости области прямого рассеяния от ширины прямого и график боковой области рассеяния от ширины бокового рассеяния и установите элемент на каждом графике, чтобы исключить дублеты. Установите область прямого рассеяния относительно графика DAPI для гейта живых ячеек. Затем создайте график противососудистого эндотелиального кадгерина в сравнении с антиэндотелиальным рецептором белка С и гейтируйте сосудистый эндотелиальный кадгерин-положительный и высокоэндотелиальный рецептор белка С.

Для индексной сортировки клеток аорта-гонад-мезонефрос поместите 96-луночный планшет, предварительно культивированный эндотелиальными клетками AGM в бессывороточной среде AGM плюс цитокины, в блок планшетов проточного цитометра и загрузите экспериментальный образец. Начните сбор образца и убедитесь, что выбран режим сортировки по индексу для сортировки отдельных ячеек для сортировки по одной ячейке в каждой лунке 96-луночного планшета. После того, как в каждую лунку планшета будет отсортирована по одной клетке, поместите планшет в инкубатор для культур тканей, установленный на 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на срок до семи дней.

В конце периода совместного культивирования гемопоэтические колонии различных размеров и морфологии могут быть визуализированы с помощью инвертированного микроскопа со 100-кратным увеличением. Для анализа клонов с помощью проточной цитометрии с помощью многоканальной пипетки отделяют кроветворные клетки от эндотелиальных слоев без отрыва эндотелиальных клеток. Затем перенесите 100 микролитров клеток в отдельные лунки новой 96-луночной V-образной пластины и верните исходную 96-луночную пластину, содержащую оставшиеся 100 микролитров клеток, в инкубатор для тканевых культур.

Гранулируйте ячейки в пластине с V-образным дном центрифугированием и удалите надосадочную жидкость, переворачивая и переворачивая пластину одним быстрым движением. Повторно суспендируйте гранулы в каждой лунке с 50 микролитрами блокирующего буфера при четырех градусах Цельсия. Через пять минут добавьте интересующий вас коктейль антител в каждую лунку для 20-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия.

В конце инкубации промойте каждую лунку 200 микролитрами PBS плюс FBS, переворачивая планшет в конце центрифугирования, чтобы сбросить надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулы в 50 микролитрах PBS плюс FBS и проанализируйте клетки в соответствии со стандартными протоколами анализа потока для скрининга колоний, содержащих потенциал гемопоэтических стволовых клеток. Отбирая лунки, содержащие клетки с фенотипом гемопоэтических стволовых клеток методом проточного анализа, с помощью многоканальной пипетки ресуспендировать оставшиеся 100 микролитров клеток из исходной совместной культуры и добавить пять раз по 10 к четвертым спасательным клеткам костного мозга по 100 мкл PBS плюс 2% FBS в каждую лунку.

После адоптивного переноса каждого клона отдельным смертельно облученным конгенным животным-реципиентам регулярно после трансплантации собирают образцы периферической крови у привитых животных. Для идентификации клонов с длительным приживлением проводят анализ образцов методом проточной цитометрии в соответствии со стандартными протоколами проточного анализа. Фенотипические свойства каждого клона затем могут быть соотнесены с его свойствами приживления.

Прегемопоэтические стволовые клетки могут быть обогащены положительным кадгерином эндотелия сосудов и высоким уровнем экспрессии рецептора эндотелиального белка С. Окрашивание другими конъюгированными с флуорохромом антителами позволяет провести ретроспективный анализ дополнительных фенотипических параметров, которые могут быть зарегистрированы для каждой клетки при сортировке индекса. После индексной сортировки по кокультурам эндотелиальных клеток аорты-гонады-мезонефроса, отдельные клоны интегрируются в слой эндотелиальных клеток аорты-гонады-мезонефроса, прежде чем клоны начинают округляться и образовывать гемопоэтические кластеры.

После пяти-семи дней совместного проживания могут быть обнаружены колонии различных размеров и морфологии. Здесь показаны четыре различные колонии, полученные после совместного культивирования, причем три колонии демонстрируют различные пропорции фенотипических гемопоэтических стволовых клеток наряду с другими, более дифференцированными типами клеток, а четвертая колония не имеет клеток с экспрессией маркеров гемопоэтических стволовых клеток. Адоптивный перенос потомства клонированных клеток позволяет оценить способность каждого клона к долгосрочному многолинейному приживлению после вклада донора в миелоидные В- и Т-клеточные компартменты периферической крови реципиента с течением времени.

Несмотря на то, что большинство колоний, содержащих клетки с фенотипом гемопоэтических стволовых клеток, достигли долгосрочного приживления, трансплантация необходима для подтверждения функционального многолинейного приживления, поскольку некоторые клоны со временем теряют приживляемость. Функциональный потенциал гемопоэтических стволовых клеток каждого клона может быть затем соотнесен с исходными параметрами сортировки индекса этого клона для определения его точных фенотипических характеристик. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как вторичное культивирование гемопоэтического потомства на строме, поддерживающей развитие В- и Т-клеток in vitro, чтобы ответить на дополнительные вопросы о лимфоцитарных потенциалах отдельных гемогенных предшественников.