Метод для последовательности целевых 16S образцов материнского молока

Общая цель этого метода заключается в амплификации 16 SRRNA из грудного молока и других образцов с низким содержанием биомассы с использованием полуавтоматического протокола. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в развитии и нарушениях микробиома человека, связанных как со здоровьем, так и с болезнями. Основное преимущество метода заключается в том, что он полуавтоматизирован, относительно прост в выполнении и адаптируется к нескольким типам образцов, включая секрет, мазки и стул.

После размораживания и приравнивания цельного молока в соответствии с текстовым протоколом вращайте образцы при температуре 5000 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы гранулировать клетки. Используйте пластиковый шпатель или наконечник пипетки с большим отверстием, чтобы удалить верхний слой жира. Затем, не тревожа гранулы, удалите всю надосадочную жидкость, кроме 100 микролитров.

Одним миллилитром PBS повторно суспендируйте и промойте гранулы. Затем приготовьте отрицательный контроль, добавив один миллилитр стерильного PBS в пятимиллилитровую пробирку. Переложите суспензию в чистую пятимиллилитровую центрифугу и вращайте ее при температуре 5000 раз G при комнатной температуре в течение одной минуты.

Затем используйте стерильный фильтрованный наконечник для пипетки объемом 1000 микролитров, чтобы удалить весь надсадочный жировой слой. Чтобы нарушить и гомогенизировать образец, добавьте в гранулу 600 микролитров лизисного буфера, содержащего бета-меркаптоэтанол, и перенесите суспензию в шариковую трубку. Подготовьте один положительный контроль с буфером для лизиса и 20 микролитрами бактериального образца.

Энергично оботрите все трубки с шариками в течение 15 секунд. Затем нагрейте образцы на вортексере с регулируемой температурой до 37 градусов Цельсия и от 700 до 800 об/мин в течение 10 минут. Загрузите пробирки в комплект адаптеров для автоматического прерывания проб.

Затем бусины взбивают образцы с частотой 30 герц в течение одной минуты. Разберите комплект адаптеров и вручную переключите его вместе с пластинами для образцов с левого роботизированного манипулятора на правый роботизированный манипулятор инструмента. Бисер взбивает пробирки при частоте 30 герц в течение еще минуты, затем центрифугирует пробирки при 17, 200 G и 25 градусах Цельсия в течение трех минут.

С помощью пипетки объемом 200 микролитров удалите всю надосадочную жидкость, стараясь не удалить жировую прослойку в верхней части или остатки шариков в нижней части образца. Нанесите надосадочную жидкость на колонки гомогенизатора. Затем центрифугируйте колонки на максимальной скорости и при температуре 25 градусов Цельсия в течение трех минут.

Перелейте 350 микролитров элуида в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку производителя. Для выделения ДНК по текстовому протоколу срежьте крышки и сгладьте края отдельных спиновых колонок для ДНК и РНК. Вставьте спиновую колонку ДНК без сборной трубки в адаптер ротора.

Затем выбросьте пробирку для сбора. Затем вставьте вихревые двухмиллилитровые пробирки в шейкер, следуя таблице загрузки автоматического прибора для очистки ДНК/РНК в соответствии с инструкциями производителя. Наклейте одну точку на пятимиллилитровые пробирки для сбора и вставьте их в адаптеры ротора.

Затем установите адаптеры ротора в центрифугу в соответствии с таблицей загрузки автоматического прибора для очистки ДНК/РНК. После введения фильтрующих наконечников, воды, не содержащей РНКазы, и реагентов в блок реагентов прибора, закройте крышку прибора и запустите на приборе специальную программу очистки ДНК. Когда реакция будет завершена, соберите образец, содержащий пробирки, из шейкера и, если какой-либо образец остался, храните его при температуре минус 20 градусов Цельсия для кратковременного хранения или при температуре минус 80 градусов Цельсия при длительном хранении.

После подготовки рабочей зоны и мастер-микса для ПЦР, в соответствии с текстовым протоколом, загрузите от 50 до 100 микролитров образцов ДНК в адаптер для образцов инструмента на 32 лунки, следуя карте планшетов на 96 лунок. Для каждой ПЦР-планшета установите два отрицательных контроля, пипетируя 30 микролитров ПЦР-воды в чистую пятимиллилитровую пробирку для сбора одной точкой. Затем поместите все образцы на 32-луночный адаптер для образцов прибора с крышками, заблокированными в открытом положении.

На адаптере реагента прибора по очереди снимите колпачок каждого обратного праймера с определенными номерами штрих-кодов. Чтобы загрузить роботизированный манипулятор для обработки жидкостей, поместите адаптер реагента в положение, B1.In чтобы избежать эффекта края, осторожно приложите один край адаптера к стороне рукоятки и медленно опустите другой край вниз. Обязательно надавите на все углы адаптеров.

Поместите адаптер для образцов в положение C1, надавливая на все углы адаптеров. Затем сделайте вихрь пятимиллилитровым мастер-миксом. Откройте колпачок и поместите его в положение A на блоке мастер-микса и реагентов прибора.

Поместите ПЦР-планшет на 96-луночный адаптер прибора, предназначенный для удержания ПЦР-планшетов с половинчатой юбкой. Затем запустите прогон и сохраните его как новый файл. Когда выполнение будет завершено, убедитесь, что ошибок не было.

Затем используйте 12 или восемь полосовых колпачков, чтобы запечатать пластину. Энергично завихрите и используйте 96-луночный спиннер для вращения пластин в течение одной минуты. Наконец, положите пластину на лед до тех пор, пока она не будет перемещена в помещение для постамплификации и загружена в термоамплификатор.

После амплификации ПЦР провести контроль качества и подготовку библиотеки согласно текстовому протоколу. Первый этап контроля качества протокола следует за ПЦР-амплификацией области 16SV4. Как показано здесь, один микролитр продукта ПЦР из каждого образца был проанализирован с помощью электрофореза, чтобы подтвердить, что он находится в пределах ожидаемого диапазона размеров от 350 до 450 пар оснований.

В некоторых образцах грудного молока было получено меньшее количество специфического продукта, что свидетельствует либо о низком уровне экстрагированной микробной ДНК в этих образцах, либо о переносе ингибиторов ПЦР во время экстракции. Количественное определение конкретного продукта для каждого образца имело важное значение для определения его необходимого объема для равного молярного пула образцов для секвенирования. В объединенной библиотеке для целевого секвенирования обычно доминирует конкретный продукт ПЦР.

Если в библиотеке имеется значительное количество неспецифического продукта, в рабочий процесс следует добавить этап очистки гелем. Результаты секвенирования демонстрируют высокое разнообразие таксонов, связанных с микробиомом грудного молока, и вариабельность количества подсчетов тростника секвенирования для каждого образца. Напротив, состав таксонов и количество тростников для бактериального макета были сопоставимы с результатами, полученными для макета в предыдущих прогонах рабочего процесса, что позволяет предположить, что наблюдаемая изменчивость образцов грудного молока является подлинным экспериментальным результатом, а не функцией внутренней вариабельности рабочего процесса.

Если оставить секвенатор работать на ночь, этот метод можно выполнить за два дня, для 12-24 образцов, если все образцы амплифицируются в первоначальном прогоне ПЦР. Если нет, то нужен еще один день снаряда. При попытке выполнить эту процедуру важно перемещаться только из зоны до ПЦР в зону после ПЦР, чтобы избежать заражения.

Также очень важно часто менять перчатки, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Не забывайте, что работа с человеческими образцами может быть опасной, поэтому всегда следует использовать меры предосторожности, такие как надлежащее защитное оборудование и шкафы биологической безопасности.