Одновременное измерение супероксид/водорода пероксида и НАДН производства флавинсодержащих митохондриальной дегидрогеназ
24 февраля 2018 г.
Митохондрии содержат несколько Флавин зависимых ферментов, которые могут производить реактивнооксигенных видов (ров). Мониторинг ROS освобождение от отдельных участков в митохондриях является сложной задачей вследствие нежелательных побочных реакций. Мы представляем простой, недорогой метод для прямой оценки родной ставок для выпуска ROS, используя чистые flavoenzymes и микроплиты флюометрия.
Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке супероксида/перекиси водорода и скорости производства NADH очищенных флавин-содержащих митохондриальных дегидрогеназ с помощью микропланшетной флуориметрии. Митрохондрии могут содержать до 12 различных сайтов образования супероксидов/перекиси водорода, которые были идентифицированы с использованием различных комбинаций субстратов и ингибиторов с изолированными митохондриями. Тем не менее, все еще остаются некоторые трудности в отношении точной количественной оценки высвобождающей способности отдельных участков производства в изолированных митохондриях.
И это связано с нежелательными побочными реакциями, которые также производят активные формы кислорода, а также с присутствием антиоксидантов и использованием ингибиторов, которым не хватает специфичности, в дополнение к использованию добавок, которые могут мешать измерениям. В данной работе мы представляем метод одновременного измерения супероксида/перекиси водорода и продукции NADH очищенными флавин-зависимыми митохондриальными дегидрогеназами. Этот метод является преимущественным, поскольку он позволяет проводить прямую и точную количественную оценку потенциала производства АФК на отдельных участках производства за счет исключения нежелательных побочных реакций и любых систем тушения активных форм кислорода.
Одновременное измерение продукции АФК и НАДН также позволяет напрямую сравнивать потенциал образования супероксида/перекиси водорода и активность отдельных ферментов, которые могут быть ценными для скрининга ингибиторов продукции АФК перед проведением анализов с митохондриями. Для наших целей здесь мы будем использовать в качестве примеров комплекс пируватдегидрогеназы и комплекс альфа-кетоглутаратдегидрогеназы свиного сердца. Оба являются флавинсодержащими ферментами и известными источниками активных форм кислорода.
Кроме того, эти два фермента могут быть легко очищены. Одновременное измерение супероксида/перекиси водорода и NADH достигается за счет отслеживания изменений во флуоресценции. NADH обладает собственными свойствами флуоресценции, что позволяет легко измерить его производство.
Между тем, для изменения супероксида/перекиси водорода требуются супероксиддисмутаза, пероксидаза хрена и ультракрасный реагент amplex. В присутствии пероксидазы хрена и перекиси водорода ультраред амплекс превращается из нефлуоресцентной молекулы в флуоресцентный резоруфин. Супероксиддисмутаза гарантирует, что любой супероксид, образованный исследуемой дегидрогеназой, превращается в перекись водорода.
Перед постановкой анализа подготавливаются рабочие растворы. Для упорядочения анализа все реактивы добавляются в лунки 96-луночной черной пластины в аликвотах по 20 микролитров. Объем для каждой реакции в лунке составляет 200 микролитров, поэтому рабочих растворов в 10 раз больше концентрации, обнаруженной в реакционной лунке.
Затем запрограммируйте считыватель микропланшетов на выполнение кинетического анализа для двойного измерения аутофлоресценции NADH и цветущей резоруфины. Для этого сначала выберите «Процедура» и установите его на 25 градусов по Цельсию. Далее нажмите «Запустить кинетику».
Установите время выполнения примерно на пять минут, а затем выберите интервал чтения флуоресценции в 30 секунд. Затем нажмите «Читать» и установите параметры измерения флуоресценции для вашего анализа. Здесь в программное обеспечение вводятся положение зонда, длины волн, используемые для отслеживания изменений цветения, и лунки, которые будут считываться.
Также выбираются различные каналы для флуоресцентных считываний, один из которых предназначен для автоцветения NADH, который настроен на 376 нанометров возбуждения и 450 нанометров длины волны излучения. Изменения во флуоресценции резоруфина отслеживаются на 565 нанометрах и 600 нанометрах. После того, как условия анализа установлены, отдельные лунки загружаются буфером и различными реагентами, необходимыми для одновременного измерения выработки NADH и супероксида/перекиси водорода.
Порядок загрузки скважин различными реагентами следующий. Сначала в лунку добавляется необходимое количество буфера, после чего добавляется 20 микролитров очищенного ферментного раствора. Фермент уравновешивается в буфере в течение нескольких минут внутри прибора.
А затем, остальные реактивы добавляются в следующем порядке. После того, как подложка будет добавлена, нажмите кнопку «Старт». Держатель пластин войдет в считывающее устройство, и будет инициирован протокол.
Во время анализа с помощью программного обеспечения можно отслеживать выходные данные в реальном времени для необработанных относительных флуоресцентных единиц (RFU). Пользователь может переключаться между различными флуоресцентными показаниями с помощью вкладки «Данные» над схемой скважины. Обратите внимание, что можно выбрать кривые для различных показаний флуоресценции.
Кроме того, удерживая Control на клавиатуре и щелкая левой кнопкой мыши по лункам, можно получить составной график, позволяющий сравнивать различные реакции в режиме реального времени. По завершении эксперимента держатель микропластин выйдет из прибора. На этом этапе результаты репрезентативного графика для изменений в RFU экспортируются в Excel.
Необработанные значения RFU экспортируются путем предварительного нажатия кнопки «Данные» на репрезентативном графике RFU. Это даст таблицу исходных значений RFU для NADH и цветущего резоруфина. Это не значит, что необработанные номера РФС, соответствующие изменениям НАДН или резоруфинового цветения, не могут быть экспортированы одновременно.
После экспорта результаты организуются для анализа. Используя стандартные кривые для НАДН и цветение резоруфина, сгенерированные до проведения анализа, можно рассчитать количество НАДН в микромолях и супероксида/перекиси водорода в пикомоле, образовавшихся с течением времени. За этим может последовать расчет скорости образования NADH и супероксида/перекиси водорода.
Для этой процедуры жизненно важно проверить чистоту выделенной флавинсодержащей дегидрогеназы перед проведением анализов. Этого можно достичь, проведя простое окрашивание кумасси на белки или проанализировав активность фермента в присутствии различных субстратов. Обратите внимание, что рекомендуется исключить из анализа восстановители, такие как DTT, поскольку они могут служить субстратом для производства супероксида/перекиси водорода флавин-связанными дегидрогеназами.
В целом, этот метод является очень гибким в том смысле, что он может быть использован для скрининга ингибиторов для производства супероксида/перекиси водорода, а также позволяет напрямую сравнивать АФК-образующую способность различных флавин-связанных митохондриальных дегидрогеназ. После просмотра этого видео у вас должно сложиться глубокое понимание того, как измерить выработку АФК и НАДН очищенными дегидрогеназами. Этот анализ может послужить трамплином для более сложных экспериментов с изолированными митохондриями.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод количественного определения скорости продукции супероксида/перекиси водорода и NADH очищенными флавинсодержащими митохондриальными дегидрогеназами с помощью микропланшетной флуориметрии. Метод позволяет решить проблемы, возникающие при измерении высвобождения активных форм кислорода (АФК) из отдельных митохондриальных центров.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Биология митохондрий
Теоретические основы
- Митохондрии содержат различные флавин-зависимые ферменты, которые генерируют АФК.
- Точное количественное определение высвобождения АФК из отдельных участков затруднено.
- Нежелательные побочные реакции и присутствие антиоксидантов осложняют измерения.
- Для идентификации мест продукции АФК использовались различные комбинации субстратов и ингибиторов.
Цель исследования
- Разработать метод одновременного измерения продукции супероксида/перекиси водорода и NADH.
- Устранить нежелательные побочные реакции при количественном определении АФК.
- Обеспечить прямую оценку потенциала продукции АФК в митохондриальных сайтах.
Используемые методы
- Использовали очищенные флавин-зависимые митохондриальные дегидрогеназы.
- Для проведения измерений применяли микропланшетную флуориметрию.
- Выполняли одновременное количественное определение супероксида/перекиси водорода и NADH.
- Для оценки отдельных участков продукции использовали специфические ингибиторы и субстраты.
Основные результаты
- Данный метод позволяет точно количественно определить скорость продукции АФК.
- Нежелательные побочные реакции были эффективно минимизированы.
- Удалось успешно оценить отдельные сайты продукции АФК.
- Данный подход обеспечивает более четкое понимание динамики митохондриальных АФК.
Выводы
- Этот метод расширяет возможности изучения продукции митохондриальных АФК.
- Он представляет собой надежный инструмент для исследователей, изучающих функцию митохондрий.
- Полученные результаты могут иметь значение для понимания окислительного стресса в клетках.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точный количественный анализ продукции активных форм кислорода (АФК) отдельными митохондриальными ферментами имеет решающее значение для валидации мишеней при поиске лекарств, связанных с окислительным стрессом. Данный метод позволяет проводить прямое сравнение образования АФК и ферментативной активности, что способствует механистическому снижению рисков при работе с мишенями флавин-зависимых дегидрогеназ. Благодаря исключению влияющих антиоксидантных систем и побочных реакций, этот подход обеспечивает прогностическую достоверность скрининга ингибиторов перед проведением сложных митохондриальных или клеточных анализов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения скорости высвобождения эндогенных АФК очищенными флавин-зависимыми дегидрогеназами.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямого измерения продукции супероксида/перекиси водорода и NADH отдельными активными центрами ферментов.
- Прогностическая ценность: облегчает отбор перспективных соединений в портфеле, позволяя проводить скрининг селективности и эффективности ингибиторов в отношении продукции АФК перед проведением митохондриальных анализов.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов рабочего процесса путем получения стандартизированных количественных показателей АФК и NADH.
- Воспроизводимость: Использование микропланшетной флуориметрии с определенными длинами волн возбуждения/эмиссии (NADH: 376/450 nm; резоруфин: 565/600 nm) для стабильного детектирования сигнала.
- Масштабируемость: Возможность проведения высокопроизводительного скрининга ингибиторов с использованием 96-луночного формата планшета с объемом реакции 200 µL.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: служит базой для проведения более сложных экспериментов с изолированными митохондриями или пермеабилизированными мышечными волокнами путем установления базовых взаимосвязей между АФК и ферментами.
- Система, релевантная патологиям: использует пируватдегидрогеназный комплекс (PDHC) и альфа-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс (KGDHC), выделенные из сердца свиньи, в качестве моделей источников митохондриальных АФК, имеющих значение при метаболических и сердечно-сосудистых заболеваниях.
- Снижение механистических рисков: позволяет определить, обусловлены ли наблюдаемые изменения уровней АФК активностью целевого фермента или же они являются следствием нецелевых эффектов или воздействия антиоксидантов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум поиска новых лекарственных средств — от ранней валидации мишени до идентификации ведущих соединений, предоставляя количественные данные об АФР и активности, которые позволяют принимать решения о целесообразности дальнейшего развития проекта перед переходом к сложным фенотипическим или доклиническим моделям.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез путем изолирования продукции АФК конкретными флавин-зависимыми дегидрогеназами, что снижает mechanistic-неоднозначность при анализе метаболических путей.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного одновременного детектирования автофлуоресценции NADH и флуоресценции резорруфина, что позволяет проводить надежную оценку соединений.
- Аналитика: Позволяет получать количественные данные (NADH в микромолях, супероксид/перекись водорода в пикомолях с течением времени), что дает возможность рассчитывать скорость продукции для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: Связывает этап открытия с доклиническими исследованиями путем определения скоростей высвобождения эндогенных АФК отдельными ферментами перед их тестированием в интактных митохондриальных системах.
- Повторное корпоративное использование: Создает многократно используемую платформу для скрининга флавин-зависимых ферментов-мишеней в различных проектах, сокращая затраты на повторную разработку методов анализа.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности при определении источников АФК.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря определенному порядку добавления реагентов, кинетическим настройкам и разделению каналов флуоресценции.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя проводить ранний скрининг ингибиторов, что снижает вероятность неудач на поздних этапах из-за непредвиденной токсичности, опосредованной АФК.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем количественной оценки потенциала выработки АФК отдельными активными центрами ферментов, что позволяет обоснованно выбирать мишени и принимать решения о дальнейшем продвижении исследований.
Особенности реализации
- Требуется опыт в очистке ферментов и постановке флуориметрического анализа, включая подтверждение чистоты флавинсодержащей дегидрогеназы с помощью окрашивания кумасси или анализов активности.
- Необходим микропланшетный ридер, способный проводить кинетические измерения на двух длинах волн (376/450 нм для NADH, 565/600 нм для резоруфина) с контролем температуры при 25°C.
- Необходимо исключить восстановители, такие как DTT, которые могут выступать в качестве субстратов для продукции супероксида/перекиси водорода и искажать результаты.
- Требуется приготовление рабочих растворов в 10-кратной концентрации, так как конечный объем составляет 200 microliter при добавлении аликвот по 20 microliter в 96-луночные планшеты.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость использования супероксиддисмутазы для преобразования супероксида в перекись водорода для последующего детектирования с помощью системы amplex ultrared/пероксидаза хрена.
