Микроинъекции эмбриона и трансплантации техника для манипуляции генома Nasonia vitripennis

Общая цель этой процедуры заключается в успешном проведении микроинъекции в эмбрионы nasonia vitripennis с целью облегчения геномных манипуляций. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с биологией nasonia vitripennis, такие как производство яда и определение пола. Основное преимущество использования этого метода заключается в том, что он позволяет напрямую манипулировать геномом осы и предлагает широкий спектр передовых геномных модификаций.

Демонстрировать процедуру будет Мин Ли, постдок из нашей лаборатории. Для начала создайте несколько колоний N.vitripennis, поместив от 200 до 500 взрослых особей с соотношением самок и самцов три к одному в клетки для жуков. Поддерживайте температуру 25 плюс-минус один градус Цельсия при относительной влажности 30% и цикле свет/темнота от 12 до 12.

В течение двух дней позвольте спаренным самкам питаться свежими куколками S.bullata, а также мелкими капельками объемом от одного до десяти на объем водным раствором сахарозы. В течение следующих двух дней удаляйте куколок мух-иглобрюхов, чтобы лишить самок ос места для откладки яиц, делая их очень весомыми. Чтобы сохранить куколок S.bullota свежими, храните их при температуре 4 градуса Цельсия сразу после получения и удаляйте только при необходимости.

Различайте молодых хозяев, у которых пупарий красного цвета, и более старых хозяев, у которых пупарий более темного цвета. Позвольте самкам ос паразитировать в молодом хозяине, поместив отдельных свежих куколок S.bullata в поролоновую пробку с отверстием размером с куколку, вырезанным в центре. Для максимальной концентрации паразитирования и облегчения сбора эмбрионов, обнажайте только около 0,2 сантиметра переднего конца хозяина, который имеет округлую форму, по сравнению с задним концом, который толще и содержит кратероподобное отверстие.

Поместите куколок-хозяев в клетку в клетке и подождите примерно 45 минут, чтобы осы могли паразитировать на них. Удалите паразитированных хозяев, извлекая их вручную и осторожно постукивая или сдувая остатки ос. Заменяйте их свежими хозяевами примерно каждые 15 минут, чтобы продолжить сбор ранних стадий яйцеклеток во время инъекций.

Под рассекающим микроскопом с помощью щипцов осторожно отслаиваются задний конец наружного зрачка только что паразитировавшего хозяина, чтобы обнажить яйца N.vitripennis. Затем приготовьте предметное стекло для выравнивания эмбриона, используя жидкий клей, чтобы приклеить защитный лист к чистому стеклянному предметному стеклу. Влажной кистью с тонким кончиком осторожно смахните эмбрионы с хозяина, стараясь не повредить мягкую кожу куколки хозяина.

Затем с помощью влажной кисти перенесите примерно 20 эмбрионов один за другим на предметное стекло, непосредственно примыкающее к боковой стороне покровного стекла. Ориентируйте передний конец эмбриона по краю покровного стекла так, чтобы задние концы эмбриона были направлены в том же направлении. Это позволит добиться более высокой точности введения в одно и то же положение среди всех эмбрионов.

После вытягивания инъекционных игл в соответствии с текстовым протоколом скосите кончик иглы, слегка коснувшись кончика алмазно-абразивной пластины при температуре 25 градусов Цельсия в течение примерно 10 секунд. Приготовьте инъекционную смесь, состоящую из реагентов для модификации генома, и держите ее на льду. С помощью наконечника микрозагрузчика загрузите в иглу для инъекций два микролитра инъекционной смеси.

Затем поместите предметное стекло с выложенными эмбрионами на предметное столико для составного микроскопа. Осторожно введите иглу в задний конец эмбриона с вертикальным углом от 25 до 35 градусов. Затем введите от одного до пяти пиколитров инъекционной смеси и следите за тем, чтобы эмбиро слегка набухал при инъекции.

Если происходит засорение, попробуйте повторно скосить иглы. Цитоплазма эмбрионов N.vitripennis необычайно вязкая и липкая, что приводит к частому закупориванию иглой. Вводите примерно от 20 до 40 яиц за один раз, а затем прекратите.

Перенесите введенные яйца влажной кистью, слегка коснувшись введенных яиц, и поместите их в организм хозяина. Затем продолжайте инъекцию, используя свежую, только что отложенную партию яиц. В идеале этот шаг наиболее эффективен, когда один человек собирает и выстраивает яйцеклетки, в то время как другой человек вводит компоненты модификации генома и пересаживает введенные эмбрионы в куколки-хозяева.

После микроинъекции с помощью влажной кисти осторожно поместите до 40 введенных эмбрионов G zero по одному на ранее ужаленную куколку S.bullata. Поместите куколок-хозяев в чашку Петри с влажной фильтровальной бумагой и ватными шариками и инкубируйте их при температуре 25 градусов Цельсия при влажности примерно 70% до тех пор, пока инъецированные эмбрионы не вылупятся примерно через один-два дня. Важно отметить, что хозяева могут остаться с очищенным пупарием, и яйца N.vitripennis будут развиваться нормально, если их инкубировать во увлажненной камере для предотвращения высыхания.

После того, как вылупятся эмбрионы с нулевым G, перенесите куколок-хозяев в новую чашку Петри и инкубируйте их при температуре 25 градусов Цельсия и влажности 70%. Ежедневно следите за куколками-хозяевами и вводимыми личинками G zero. Если куколки-хозяева имеют неприятный запах, перенесите введенные личинки на новых здоровых куколок-хозяина.

Для эффективного проникновения иглы и микроинъекции в эмбрионы N.vitripennis были протестированы различные микропипетки с несколькими типами игл из капиллярного стекла с филаментами, включая кварц, алюмосиликат и боросиликат, чтобы получить желаемый подкожный длинный кончик, эффективный для микроинъекции эмбрионов N.vitripennis. Компоненты модификации генома, использованные здесь, представляли собой смешанные направляющие РНК и белок cas9 для более четкого редактирования генома. В этом эксперименте sgРНК, нацеленная на ген киновари, вводилась в различных количествах вместе с белком cas9 в N.vitripennis.

Из этой таблицы видно, что показатели выживаемости зависели от дозы, так как повышенная концентрация sgRNA и белка cas9 приводила к снижению выживаемости. При попытке выполнить эту процедуру важно следить за тем, чтобы не проколоть и не высушить эмбрионы ос во время манипуляций или переноса, осторожно используя увлажненную кисть с тонким концом или выбор эмбрионов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как эффективно извлекать, микроинъекции и пересаживать эмбрионы ос, чтобы успешно выполнять расширенные модификации генома.