Визуализация корковых модулей в плоский млекопитающих коре

Эта статья описывает подробная методология для получения уплощенных секции касательной от млекопитающих коре и визуализировать корковых модули, используя гистохимические и иммуногистохимических методов.

Общей целью этой процедуры уплощения и окрашивания коры головного мозга является визуализация клеточных модулей в областях коры головного мозга послойно. Этот метод может ответить на ключевые вопросы нейробиологии, например, как структура коры головного мозга распространяется на мозг и как она может быть связана с функцией. Основное преимущество этой техники заключается в том, что вы можете сравнивать кортикальную архитектуру в ламинальной манере, и сравнивать различные ее аспекты, например, как она сохранила эволюцию класса или как она изменяется по функциям.

Демонстрировать технику будут Саймон Лауэр и Ундина Шнеевейб, студентка и техник из лаборатории профессора Мишель Блэк. Для начала необходимо провести транскардиальную перфузию животного для получения однородно зафиксированного и бескровного мозга. После удаления мозга погрузите его в 0,1 молярного фосфатного буфера.

Если желательны участки с большими областями коры головного мозга, сделайте мозг плоской перед дальнейшей постфиксацией. Однако, чтобы получить участки более труднодоступных областей, таких как медиальная энторинальная кора, зафиксируйте мозг в 4% PFA в течение 24 часов до уплощения. Приготовьтесь поддерживать мозг влажным с помощью буфера в течение всего вскрытия.

Для начала разделите полусферы с помощью скальпеля. Если мозг не зафиксирован, будьте осторожны при обращении с ним. Далее, фиксируя мозг мозжечком, аккуратно введите шпатель, чтобы открыть плоскость рассечения в мозолистом теле.

Круглый кончик шпателя должен быть направлен в сторону от коры головного мозга. Затем манипулируйте шпателем, чтобы разделить таламус и кору головного мозга. Далее отделите подкорковые структуры с помощью лезвия бритвы.

Далее отделите подкорковые структуры с помощью скальпеля или края шпателя. Чтобы улучшить уплощение, сделайте чистый разрез через стриатум, прилежащее ядро и лобную кору орбиты, так как они увеличивают толщину коры в латеральной области. Затем добавьте облегчающий разрез у основания внутренней области префронтальной коры.

Это позволит развернуть медиальные участки коры головного мозга. Теперь поместите полусферическую кору вниз на предметное стекло. Затем поместите два глиняных цилиндра по обе стороны от ткани.

Глина должна быть на 10-20% тоньше, чем ткань мозга, так как глина определяет степень сплющивания. Затем поместите стеклянную сторону по касательной к коре головного мозга, сначала соприкасаясь с боковой частью. Затем установите груз на стакан так, чтобы масса была центрирована над боковой частью.

Теперь дайте сборке постоять от трех до пяти часов в фосфатном буфере при температуре четыре градуса Цельсия. Настоящий ключ к этой подготовке заключается в том, чтобы сделать мозг как можно более плоским, так как это оказывает наибольшее влияние на просмотр карты коры головного мозга. Наконец, при необходимости, зафиксируйте мозг.

Перенесите сплющенное полушарие на 1% PFA, или 2% PFA, если оно не было взято у животного, подвергшегося перфузии. Затем дайте ему зафиксироваться в течение 24 часов при температуре 4 градуса Цельсия, слегка помешивая. Сначала промойте сплющенную полусферу в фосфатном буфере в течение 15 минут.

Затем разрежьте полушарие по касательной на вибратоме. Зафиксируйте ткань в нужном положении с помощью небольшого объема цианоакрилата и мягкого нажатия. Будьте осторожны, так как слишком большое количество клея может привести к появлению дефектов пореза.

Теперь обрежьте полусферу от более толстого и устойчивого конца к более тонкому концу на необходимой толщине. Если использовались низкие концентрации фиксаторов, разрезайте ткань медленно с высокой амплитудой. Далее промойте разрезанную ткань в буфере hepes в течение 15 минут с легким помешиванием.

Во время стирки приготовьте свежий раствор для окрашивания цитохромоксидазы. И добавьте компонент DAB непосредственно перед его использованием. Теперь инкубируйте срезы в свежеприготовленном растворе для окрашивания при комнатной температуре с помощью шейкера и следите за происходящим.

В зависимости от степени фиксации, окрашивание может быть заметно через 10 минут или через несколько часов. Если реакция протекает слишком медленно, увеличьте температуру до 37 градусов по Цельсию. Чтобы остановить реакцию, переложите секции в ванну с 4% PFA и дайте им поинкубироваться в течение 15 минут при легком перемешивании.

Затем промойте секции три раза, с буфером хепса в течение 10 минут за одну стирку. Теперь закрепите и высушите секции на стеклянных предметных стеклах. И обезвоживайте их, используя все более сильные ванны с этанолом.

Затем промойте предметные стекла в изопропаноле в течение пяти минут, а затем в ксилоле в течение пяти минут. После ванны с ксилолом сразу же добавьте быстрозатвердевающий монтажный материал, не содержащий воды. Среды на водной основе ухудшают пятно.

После добавления защитного стекла храните предметные стекла при температуре четыре градуса Цельсия до получения изображения. Корковые участки соматосенсорной коры головного мозга в различных видах мозга обрабатывались с помощью описанных процедур. Этот сравнительный подход позволяет изучать эволюционные силы, формирующие кору головного мозга, такие как высококонсервативное представление мистических вибрисс у грызунов и зайцеобразных в виде бочек.

Архитектура медиальной энторинальной коры была изучена на участках, параллельных поверхности кожуры, с использованием тангенциального разреза медицинской энторинальной коры у мышей, крыс и египетских летучих мышей. Кроме того, человеческий мозг обрабатывался с помощью мягкого сплющивания коры головного мозга и тангенциальных срезов. Весь мозг был криоконсервирован и разрезан на криостате с температурой 60 микрон.

Иммуноокрашивание использовали для мечения кальбиндин-положительных модулей парамеатальных клеток. В энторинальной коре модули кальбиндина демонстрируют замечательную периодичность у каждого вида и изменяются по размеру всего в 10 раз, при этом размер мозга варьируется в 20 000 раз. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить тангенциальные сечения для анализа.

Однажды, освоив эту технику, можно пройти за пару часов. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о правильном выравнивании мозга, а не о размере, качестве или конечных результатах. Не забывайте, что работа с такими агентами, как PFA и DAB, может быть чрезвычайно опасной, поэтому вы всегда должны носить защитную одежду и работать под полевым освещением.