Культуры главной ячейки от мыши пигментный эпителий сетчатки

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать возможный способ получения клеток пигментного эпителия сетчатки из глаз мышей и культивирования их in vitro с сохранением их исходных свойств. Этот метод поможет исследователям RPE получить навыки препарирования, необходимые для создания клеточных культур RPE у мышей, и продемонстрировать, как это сделать простым способом. Главное преимущество этой процедуры в том, что она проста и выполнима.

Требуется только практика, а наглядная демонстрация выделения СИЗОД и микроскопия в буквальном смысле демонстрирует, как получить необходимые навыки. Чтобы изолировать глазные яблоки мыши, сначала усыпьте двух мышей любым утвержденным методом, а надев перчатки, положите их на впитывающую подушечку. Расположите большой и указательный пальцы вокруг глаза и осторожно надавите на кожу, чтобы глазное яблоко выпячивалось.

Как только глазное яблоко выступит, просуньте кончик ножниц под углом между кожей и глазным яблоком и осторожно разрежьте ткань вокруг глаза, пока она не освободится. Затем ненадолго окуните изолированный глаз в 70% этанол и погрузите его в PBS в чашку Петри. Собрав оба глаза у каждой из мышей, приступайте к вскрытию.

Под препарирующим микроскопом осторожно удалите большую часть соединительной ткани вокруг глаза. Во время этого шага не обязательно держать глаз погруженным в воду. Для этого с помощью швов приподнимают соединительные ткани из глазного яблока, а вырезают их с помощью ножниц Ваннаса.

Не режьте склеры, потому что практически невозможно получить неповрежденные задние наглазники, если склера будет разрезана. После очистки соединительной ткани погрузите глазные яблоки в PBS, и перейдите к работе в ламинарном шкафу в стерильных условиях. Теперь с помощью щипцов перенесите глаза в миску с теплым DMEM, содержащим высокую концентрацию глюкозы.

Через 20-30 секунд замените раствор для стирки с помощью аспирации для повторной стирки. Перенесите глазные яблоки в подогретый рабочий раствор 2% Dispase II в пробирках объемом 15 мл и дайте глазам инкубироваться при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45 минут для диссоциации. После инкубации глазные яблоки должны быть мягкими.

Далее промойте глаза два раза в одном и том же сосуде с подогретой питательной средой. После второго промывания замените питательную среду на свежую среду, а глазные яблоки и среду переложите в новую посуду для продолжения вскрытия. Продолжайте работу на чистом стенде с помощью диссекционного микроскопа.

Начните диссекцию, закрепив глаз щипцами и сделав разрез вокруг ora serrata с помощью ножниц Vannas. Удерживая глазное яблоко в растворе, осторожно удалите переднюю роговицу, удлинив разрез по окружности ora пильчатой дуги. После завершения разреза оттяните переднюю роговицу.

Затем удалите капсулу хрусталика и связанный с ней пигментированный эпителий радужной оболочки, аккуратно вытащив ее из наглазника с помощью зубчатых щипцов. Затем повторите рассечение на оставшихся глазах и инкубируйте задние глазные чашки в питательной среде в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы облегчить отделение нервной сетчатки от РПЭ. Через 20 минут разрежьте задние наглазники на четыре лепестка.

Сделайте надрезы достаточно длинными, чтобы сделать наглазник плоским, но достаточно короткими, чтобы лепестки были соединены. Затем расплющите наглазник, чтобы удалить нервную сетчатку. Закрепите оставшийся комплекс склеры РПЭ хориоидеи недоминантной рукой и очень аккуратно оттяните сетчатку от краев.

После удаления нервной сетчатки перенесите четвертованный комплекс склеры сосудистой оболочки RPE в новую стерильную чашку для культуры, наполненную теплой питательной средой. В чашке Петри закрепите один лепесток четвертованного комплекса склеры РПЭ с помощью сверхтонких щипцов и с помощью микрохирургического ножа в форме полумесяца аккуратно отклейте неповрежденные листы РПЭ от нижележащей базальной мембраны. Коричневатый РПЭ должен быть хорошо отличим от темной, липкой, пушистой сосудистой оболочки.

Затем смочите наконечник микропипетки p200 питательной средой и с помощью этого наконечника переложите листы СИЗОД в новую чашку, содержащую подогретую питательную среду. Теперь трижды промойте листы РПЭ в подогретой питательной среде. После каждого этапа промывки тщательно собирайте листы RPE, избегая других тканей, таких как мусор сетчатки или сосудистой оболочки.

После последней промывки переложите листы СИЗД в пробирку объемом 1,5 мл и дайте им отстояться под действием силы тяжести. Затем в ламинарном проточном шкафу удалите лишнюю питательную среду и снова подвесьте клетки в свежеприготовленной теплой питательной среде. Теперь аккуратно растирайте ткань с помощью микропипетки p200, не образуя пузырьков.

Растирайте от 40 до 50 раз, как раз достаточно, чтобы получить одноклеточную суспензию. Будьте осторожны, так как слишком сильное растирание может привести к летальному исходу. Теперь поместите клетки RPE, собранные у обеих мышей, в одну мембранную вставку из полиэстера объемом 12 мл в лунку культурального планшета на 12 лунок.

Требуется высокая плотность клеток, чтобы клетки RPE сохраняли свою гексагональную форму и пигментацию. Первичная культура РПЭ у мышей, полученная от двух мышей в 12-миллиметровой мембранной вставке из полиэстера, достигла от 90 до 95% конфлюенции после одной недели в культуре. После двух недель культивирования клетки были на 100% слиты и начали образовывать мозаику из гексагональных пигментированных и двухядерных клеток.

К третьей неделе клетки продолжали изменять форму и пигментацию. Однако через четыре недели часть клеток стала гиперпигментированной. Чистоту первичной культуры клеток РПЭ оценивали с помощью антитела RPE65, которым мечется ретиноидизомергидролаза, фермент, критически важный для зрительного цикла позвоночных.

Целостность клеточных соединений и гексагональная форма клеток была продемонстрирована путем окрашивания фаллоидином. Плотные соединения были визуализированы с помощью анализа экспрессии белка ZO-1, который можно было визуализировать с помощью аминоокрашивания и подтвердить с помощью вестерн-блоттинга. В целом, культуры способны размножаться, сохранять пигментацию и свою гексагональную форму, образуя плотные соединения и экспрессируя функциональные маркеры, такие как RPE65.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить клетки РПЭ из глаз мыши и правильно культивировать их in vitro. После освоения этой техники ее можно сделать за три часа, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что глаза всегда должны быть влажными и стараться действовать как можно быстрее.