Assay ремонт мембраны клеток с помощью двух Фотон лазерный микроскоп

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке способности к восстановлению плазматических мембран в клетках пациента с мышечной дистрофией. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы при мышечной дистрофии, например, какова связь между данной мутацией и кинетикой восстановления мембраны. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет количественно оценить кинетику повторного герметизации мембраны в живых клетках в режиме реального времени.

Начните с культивирования клеток фибробластов в колбе T225, содержащей 40 миллилитров питательной среды, в инкубаторе с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Когда конфлюенция культуры достигнет 70-80%, промойте клетки два раза 40 миллилитрами PBS на одну промывку с последующим добавлением пяти миллилитров 0,05% трипсина в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. Когда клетки отделятся, остановите реакцию с помощью 40 миллилитров свежей питательной среды и засейте два миллилитра клеток в концентрации 100 000 клеток на миллилитр в 35-миллиметровые стеклянные пластины со стеклянным дном, покрытые коллагеном, для ночной инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.

Добавьте 150 микролитров свежей среды, лишенной сыворотки, в одну 1,5-миллилитровую пробирку на трансфекционную культуру. Далее добавьте в каждую пробирку по три микролитра реагента для трансфекции, и инкубируйте пробирки не менее пяти минут при комнатной температуре. Пока пробирки инкубируются, добавьте 175 микролитров среды, полученной из сыворотки, и 3,5 микрограмма плазмидной ДНК дисферлина в дополнительную 1,5-миллилитровую пробирку на тарелку.

Затем соедините 150 микролитров раствора плазмидной ДНК со 150 микролитрами реагента для трансфекции в одну новую пробирку на каждую пластину для 20-минутной инкубации при комнатной температуре. На следующее утро замените питательную среду двумя миллилитрами среды, полученной из сыворотки. В конце инкубации равномерно распределите все 300 микролитров плазмидного раствора по каждой пластине, и инкубируйте пластины в течение 24 часов в инкубаторе с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день замените надосадочную жидкость плазмиды свежей питательной средой и верните планшеты в инкубатор еще на 24 часа. Чтобы подготовить клетки к анализу на двухфотонное ранение, необходимо однократно промыть трансфицированные культуры одним миллилитром раствора Тирода. Затем добавьте в клетки один миллилитр свежего раствора Тирода, дополненного одним микролитром 2,5-миллимолярного красителя FM4-64.

Затем, используя инвертированный конфокальный микроскоп, создайте мишень размером 0,2 на два микрона в программном обеспечении микроскопа и поместите мишень на краю клеточной мембраны так, чтобы линия мишени перекрывалась и лежала перпендикулярно клеточной мембране. Выберите 543-нанометровый гелий-неоновый лазер для возбуждения сигнала FM-красителя и 488-нанометровый аргоновый лазер для возбуждения сигнала GFP, а также установите диапазон обнаружения от 600 до 760 нанометров и от 500 до 550 нанометров соответственно. Затем создайте пятиминутный временной ряд последовательных сканирований изображений.

Чтобы создать мембранное повреждение, используйте двухфотонный лазер с яркостью 820 нанометров при мощности лазера 15% с 10 итерациями для отбеливания клеток через 25 секунд после начала временного ряда. Чтобы количественно оценить флуоресценцию красителя FM4-64, с помощью программного обеспечения нарисуйте область интереса размером шесть на шесть микрон и поместите область интереса рядом с местом ранения внутри клетки. Затем вычтите фоновое значение и разделите чистый прирост на значение флуоресценции в нулевой момент времени, чтобы рассчитать относительные значения флуоресценции для каждой точки времени.

Здоровые клетки фибробластов человека демонстрируют низкие уровни активации флуоресценции FM4-64 после лазерного ранения, в то время как фибробласты пациентов, не получавших лечения, демонстрируют высокую степень относительной интенсивности флуоресценции после травмы. Клетки пациентов, которые были трансфицированы полноразмерной дисферлиновой плазмидой, демонстрируют сниженную относительную интенсивность флуоресценции FM4-64 по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения, но аналогичные значениям флуоресценции, наблюдаемым у здоровых контрольных групп. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что клетки будут медленно умирать в буферном растворе, поэтому работайте быстро и регулярно переходите на свежие клетки.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как регенерировать повреждения мембраны с помощью двухфотонного микроскопа и как количественно оценить повторное герметизацию мембраны в режиме реального времени.