Иммунопреципитация родной Chromatin, с использованием Neurospheres опухоли мозга мышиных

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении обогащения гистоновых меток в определенном месте генома. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, например, как мутации в эпигенетических регуляторах, которые изменяют модификации гистонов, влияют на транскриптом опухолевых клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что клетки не сшиты, поэтому они находятся в более естественном состоянии, что может помочь специфичности антител.

Начните с препарирования экспериментально индуцированной опухоли из мозга мыши в 10-сантиметровой чашке Петри. Если опухоль экспрессирует флуоресцентный белок, визуализируйте опухоль через флуоресцентный препарирующий микроскоп, установленный на соответствующий флуоресцентный канал с увеличением в 0,3 раза. Используйте скальпель и щипцы, чтобы отделить опухолевую ткань от нормального мозга, и измельчите опухоль на мелкие кусочки в чашке Петри.

Перенесите рассеченную опухоль в пробирку объемом 1,5 миллилитра с 300 микролитрами среды NSC и с помощью одноразового шприца аккуратно гомогенизируйте опухоль. Затем добавьте один миллилитр среды для отслоения клеток и инкубируйте образец в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации пропустите клеточную суспензию через сетчатый фильтр 70 микрон в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров.

Затем промойте ситечко 25 миллилитрами среды NSC и центрифугируйте суспензию при 300-кратном G в течение пяти минут при комнатной температуре. После сцеживания надосадочной жидкости повторно суспендировать гранулу в шести миллилитрах среды НСК и перенести суспензию опухолевых клеток в колбу для культуры Т25. Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для культивирования тканей с атмосферой 95% воздуха и 5% углекислого газа до образования нейросфер.

После того, как нейросферы собраны, центрифугируйте от одного до 10-шести клеток нейросферы в одном осаждении в 300 раз G в течение пяти минут. После центрифугирования сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу нейросферы в одном миллилитре сбалансированного раствора соли. Перенесите суспензию в микроцентрифужные пробирки с низким содержанием связывания белков объемом 1,5 миллилитров, затем центрифугируйте, как и раньше.

Затем сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 95 микролитрах буфера для пищеварения, дополненного коктейлем ингибитора протеазы в соотношении 10 из шести клеток. Немедленно пипетируйте клетки вверх и вниз, чтобы предотвратить образование комков и образования пузырьков. Затем смешайте пять микролитров 0,1X микрококковой нуклеазы в 145 микролитрах буфера для пищеварения и добавьте пять микролитров разбавленной микрококковой нуклеазы в расчете на 10 раз на шесть клеток.

Перемешайте тюбик и поместите трубку в термоблок с температурой 37 градусов Цельсия ровно на 12 минут. Расщепление микрококковой нуклеазы до фрагмента хроматина является наиболее важным этапом. Правильная фрагментация хроматина важна для достижения высокого разрешения ChIP.

Чтобы обеспечить успешное выполнение этого этапа, инкубируйте несколько образцов по одному, чтобы не допустить переваривания. Через 12 минут добавьте 10 микролитров 10-кратного буфера для стоп-буфера микрококковой нуклеазы в расчете на 10 раз на шесть клеток. С этого момента образцы должны храниться на льду.

Биоанализирующий анализ образца, расщепленного микрококковой нуклеазой, показывает, что большая часть ДНК была фрагментирована на моно-, ди- и трехнуклеосомы. Затем добавьте 110 микролитров 2X ripa буфера, дополненного один к 100 с коктейлем ингибиторов протеазы, в соотношении 10 к шести клеткам. Переверните пробирку, чтобы перемешать, затем центрифугируйте в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в 1700 раз по Г. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую хроматин, в обычную микроцентрифугу объемом 1,5 миллилира и положите на лед.

Используйте рипа-буфер с добавлением ингибиторов протеазы в соотношении один к 1000 для разбавления хроматина, чтобы каждый IP имел объем от 100 до 200 микролитров. Затем удалите аликвоту, эквивалентную 10% объема ChIP, в качестве входной выборки. Приготовьте вход, добавив 100 микролитров TE-буфера с добавлением протеиназы К, и инкубируйте при температуре 55 градусов Цельсия в течение одного часа.

После очистки входного сигнала с помощью набора для очистки ПЦР измерьте концентрацию входного сигнала с помощью микрообъемного спектрофотометра. Запишите результаты в блокнот. Добавьте 10 микролитров промытых белковых магнитных шариков A и G на каждый образец, который будет выполнен на каждом образце, и инкубируйте в течение одного часа при температуре 4 градуса Цельсия с вращением со скоростью 20 оборотов в минуту.

Поместите образец на магнитный держатель и дайте шарикам разойтись, затем переложите необходимый объем в новые 1,5-миллилитровые пробирки. Добавьте желаемое антитело в каждую пробирку, а затем оберните крышки пластиковой парафиновой пленкой, чтобы избежать испарения. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия с вращением, как и раньше.

На следующий день вращайте трубки при 2000 умноженных на G в течение 10 секунд, затем добавьте по 10 микролитров шариков в каждую IP и инкубируйте в течение 3 часов при температуре 4 градуса Цельсия с вращением со скоростью 20 оборотов в минуту. Затем поместите образцы на магнитную подставку и дайте магнитным бусинам разойтись. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость, затем добавьте 150 микролитров рипа-буфера с ингибиторами протеазы в каждый IP и инкубируйте при температуре 4 градуса Цельсия при 20 об/мин в течение пяти минут.

После инкубационного периода поместите образцы на магнитную подставку и дайте магнитным шарикам разойтись. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость, затем добавьте 150 микролитров буфера из хлорида лития, дополненного ингибиторами протеазы в низкой концентрации, в каждый IP, и инкубируйте при температуре 4 градуса Цельсия с вращением при 20 об/мин в течение пяти минут. После инкубационного периода поместите образцы на магнитную подставку и дайте магнитным шарикам разойтись, затем с помощью пипетки удалите надосадочную жидкость.

Затем добавьте в бусины 150 микролитров холодного TE без ингибиторов протеазы и инкубируйте при температуре 4 градуса Цельсия с вращением при 20 оборотах в минуту в течение пяти минут. После заключительной стадии промывки повторно суспендируйте образец в 100 микролитрах TE-буфера с добавленной конечной концентрацией 0,5 мг на миллилитр протеиназы К, и инкубируйте при температуре 55 градусов Цельсия в течение одного часа. Наконец, очистите осажденную аминокислотами ДНК с помощью набора для очистки ПЦР.

Затем, чтобы проверить, является ли ИП успешной, проводят кПЦР с праймерами, нацеленными на положительные и отрицательные контрольные области. КПЦР проводили с использованием ДНК IGG CHIP, гистона-3-лицена-4-триметилированной ДНК ChIP и гистона-3-лицена-27-триметилированной ДНК ChIP, используя праймеры для глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы. Репрезентативные результаты показывают, что Gapdh, бытовой ген, обогащен только модификацией H3K4me3, связанной с активной транскрипцией, а не модификацией H3K27me3, связанной с подавленным хроматином.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ChIP-C, для выявления изменений в гистоновых метках по всему геному. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить нативную ChIP в нейросферах для выявления гистоновой метки на конкретных участках генов.