Photoconversion одноклеточных в живых нетронутыми данио рерио

Общая цель этого метода фотоконверсии состоит в том, чтобы отличить отдельные клетки у одного животного от других популяций флуоресцентных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы развития в этой области и позволить нам визуализировать миграцию одиночных клеток с течением времени. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она является минимально инвазивной и может использоваться для мечения отдельных клеток или более крупных популяций.

Кроме того, пользователь может выбрать конкретную область интереса и сфотографировать нужную цель. После спаривания самцов и самок трансгенных данио-рерио, экспрессирующих фотоконвертируемый белок, и сбора яиц в соответствии с текстовым протоколом, используйте препарирующий микроскоп с 488-нанометровым источником света и наборами фильтров GFP для скрининга 24 эмбрионов HPF. С помощью иглы или пинцета вручную дехорионизируйте эмбрионы.

Приготовьте в микроволновой печи пять миллилитров 0,8%-ного раствора агарозы с низкой температурой плавления. Как только агароза остынет на ощупь, поместите три-четыре обезболенные трансгенные рыбы sox10 eos positive 48 hpf в центр чашки Петри со стеклянной крышкой. Добавьте примерно один миллиметр, или достаточно агарозы, чтобы покрыть поверхность покровного стекла.

Затем с помощью иглы щупа расположите рыб на боку, регулируя их по мере необходимости, пока агароза застывает, что займет около двух минут. После того как агароза застынет в течение двух минут, медленно добавьте в чашку зародышевую среду, содержащую 0,02% эфира аминобензойной кислоты трикаина, до тех пор, пока нижняя поверхность агара и чашки не будет погружена. Чтобы провести конфокальную микроскопию, откройте конфокальную программу и выберите окна захвата и фокусировки.

Чтобы выполнить предварительную конверсионную визуализацию, в раскрывающемся списке «Окно захвата» и «Настройка захвата» выберите параметры изображения. Вот специфичная для лаборатории настройка стека называется визуализацией рыб. Поместите образец на конфокальный микроскоп и с помощью ручек грубой и точной регулировки сфокусируйте его.

Затем откройте окно фокусировки и найдите нужную область интереса, например, ганглий дорсального корешка. В меню набора фильтров выберите лазер c488, установите выдержку на 300 миллисекунд, мощность лазера на пять и интенсификацию на 75. Далее, в разделе типа захвата, установите флажок 3D.

В разделе «3D-захват» выберите «Использовать текущее положение» и проверьте диапазон вокруг текущего. В этом же разделе установите диапазон равным 35, количество плоскостей равным 36 и размер шага равным одному. Выберите текущее местоположение, затем нажмите кнопку «Пуск» в нижней части окна съемки, чтобы получить изображение.

Перед процессом фотоконвертации обязательно дважды и трижды проверьте параметры лазера. Иногда возникает необходимость перенастроить настройки конвертации, когда окно конвертации открыто. В окне захвата на раскрывающейся вкладке Настройка окна захвата выберите параметр преобразования изображения для конкретной лаборатории.

Здесь специфическая для лаборатории настройка называется, рыба аблирует полный чип. В меню фильтров выберите лазеры c488 и c541. Установите выдержку на 300 миллисекунд, мощность лазера на пять, а интенсификацию на 75, что позволит производить достаточное количество флуоресцентного сигнала, не вызывая фотообесцвечивания или токсичности.

В окне фокусировки нажмите на вкладку фотоманипуляции, измените мощность лазерного стека на два, а затем нажмите «Перейти». Измените размер растрового блока на один и нажмите Установить. Затем измените размер двойного клика на четыре, а лазерную линию на v405.

Далее в окне захвата откройте расширенные настройки захвата. Выберите вкладку фотоманипуляции и измените количество повторений двойного клика на два, затем нажмите OK. Выберите вкладку xy в окне фокусировки.

Во вкладке фотоманипуляции еще раз проверьте параметры лазера. Затем установите настройки лазера для фотопреобразования интересующей клетки без фотопреобразования окружающих ячеек. В разделе «Тип захвата» установите флажок «Таймлапс» и нажмите «Начать».

Как только откроется окно таймлапса в реальном времени, выберите инструмент круга на верхней панели инструментов. Нарисуйте круг в самой центральной области ячейки, затем щелкните правой кнопкой мыши нарисованный круг, выберите «Область FRAP» и подождите три секунды. Выделенная область должна стать более тусклой, когда она все-таки нажмет стоп захвата.

Если вы визуализируете более одного животного, вернитесь на вкладку xy в меню фокусировки и выберите вторую позицию. Затем повторите фотоконвертацию. Чтобы преобразовать популяцию клеток, следуйте протоколу и лазерным перометрам, открыв окно таймлапса.

Теперь вместо того, чтобы рисовать круг для FRAP области интереса, используйте инструмент «Линия», чтобы нарисовать линию на области интереса. Затем выполните FRAP для региона, используя те же параметры, которые только что были продемонстрированы. После того как все точки будут фотопреобразованы, на раскрывающейся вкладке настроек захвата в окне захвата выберите стандартную настройку стека для конкретной лаборатории, описанную ранее в этом видео.

Выберите лазер c488 и установите экспозицию на 300 миллисекунд, мощность лазера на пять, а интенсификацию на 75. Выберите лазер c541 и установите экспозицию на 500 миллисекунд, мощность лазера на десять и интенсификацию на 75. В разделе Тип захвата установите флажок 3D.

В разделе «3D-захват» выберите «Использовать текущее положение» и проверьте диапазон вокруг текущего. В том же разделе установите диапазон равным 35, количество плоскостей равным 36 и размер шага равным одному. Число диапазона может увеличиваться или уменьшаться в зависимости от желаемой глубины изображения.

Если на вкладке фокуса xy есть несколько точек, в окне захвата выберите опцию списка с несколькими точками. Если нет, выберите текущее местоположение. Наконец, в нижней части окна захвата нажмите «Старт», чтобы получить изображение.

На этих панелях показана одна префото-конверсионная клетка в ганглии трансгенной рыбки данио-рерио, экспрессирующая фотоконвертируемый белок eos под контролем регуляторной последовательности sox10. После фотоконверсии eos отчетливо присутствовал в пределах исследуемой области, в то время как соседние клетки не были помечены. Чтобы продемонстрировать полезность этого метода фотоконверсии, популяция клеток в вентральной части спинного мозга подвергалась воздействию ультрафиолетового света с помощью линии.

После этого были сделаны изображения, показывающие фотопреобразованный белок eos в области линии. Нефотопреобразованный белок eos был виден во всех остальных областях. Через несколько часов после фотоконверсии были сделаны идентичные изображения, на которых были видны фотопреобразованные eos-положительные клетки, разбросанные по всей области спинного мозга, как в дорсальном, так и в вентральном расположении.

Этот вывод согласуется с гипотезой о том, что вентральные клетки спинного мозга переместились в дорсальные места. После освоения этой техники ее можно выполнить за 30-45 минут, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно не забыть сделать изображение после конверсии, чтобы подтвердить, что в интересующем вас регионе действительно произошла фотоконверсия.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как покадровая визуализация, чтобы наблюдать за миграцией клеток и динамикой с течением времени. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как различать отдельные клетки в популяции флуоресцентных клеток. Не забывайте, что работа с ультрафиолетом может быть крайне опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать необходимые меры предосторожности.

Например, никогда не смотрите прямо на свет.