Пролиферации и дифференцировки Murine миелоидного прекурсоров 32D/G-CSF-r клетки

Общая цель данного эксперимента заключается в генетической модификации миелоидных клеток мыши линии 32D-G-CSF-R путем гиперэкспрессии или сайленсинга интересующего гена с последующим определением влияния этих изменений на пролиферацию и нейтрофильную дифференцировку данной клеточной линии. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области гематологии, например, о том, каким образом исследуемый вами белок может быть задействован в росте и дифференцировке миелоидных клеток-предшественников. Основным преимуществом этой клеточной линии является ее неограниченная способность к пролиферации, восприимчивость к генетическим манипуляциям, относительно низкая стоимость, а также обеспечение степени биологического упрощения, необходимой в определенных экспериментальных подходах. Демонстрацию процедуры сегодня проведет Петр Данек, аспирант моей лаборатории.

Приготовьте 250 миллилитров среды RPMI-1640, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки и 10 нанограммами на миллилитр мышиного интерлейкина-3. Затем приготовьте 50 миллилитров дифференцировочной среды.

В чашку Петри диаметром 16 см высейте суспензию одиночных клеток Bosc23 в 18 мл среды DMEM, дополненной 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Культивируйте примерно 24 часа до достижения конфлюэнтности 80%. Затем смешайте ретровирусную конструкцию MSCV, упаковочный вектор PCL-echo, полиэтиленимин и среду с пониженным содержанием сыворотки без антибиотиков. Инкубируйте эту смесь в Flowbox при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем осторожно замените среду культивирования клеток Bosc23 на 16 мл предварительно нагретой до 37 °C среды DMEM, дополненной 2% эмбриональной бычьей сыворотки. Далее по каплям добавьте ретровирусную смесь к клеткам Bosc23. Затем инкубируйте культуру при 37 °C в течение четырех часов.

По окончании инкубации аспирируйте культуральную среду Bosc23 и добавьте 18 мл предварительно подогретой среды DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 48 часов. С помощью серологической пипетки на 25 мл перенесите среду, содержащую вирус Bosc23, в коническую пробирку объемом 50 мл. Храните пробирку при температуре 4 °C. Затем добавьте к клеткам Bosc23 18 мл предварительно подогретой среды DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки и культивируйте клетки в течение 24 часов.

Центрифугируйте вирусный супернатант при 1,500 ×g в течение 10 минут при температуре four °C. Затем разделите вирус на аликвоты и подвергните шоковой заморозке с помощью жидкого азота для последующего хранения при температуре minus 80 °C.

В каждую лунку планшета на шесть лунок высейте клетки NIH/3T3 в трех миллилитрах среды DMEM, дополненной 10% fetal bovine serum, для титрования одного вируса. Культивируйте клетки в течение ночи при 37 °C. На следующий день разведите вирус предварительно подогретой средой, не подвергая вирусные частицы воздействию вортекса. Аспирируйте культуральную среду из лунок с клетками NIH/3T3 и добавьте в каждую лунку один миллилитр разведенного вируса. Инкубируйте при 37 °C в течение ночи. На следующий день осторожно аспирируйте разведенную вирусную среду и замените ее двумя миллилитрами среды DMEM с 10% fetal bovine serum, затем снова инкубируйте при 37 °C в течение ночи. После инкубации аспирируйте старую среду и замените ее средой DMEM, содержащей пуромицин в концентрации 2 µg/mL. Продолжайте культивировать клетки, меняя среду каждые три дня или чаще, если среда желтеет, заменяя ее свежей средой, содержащей пуромицин.

На 10-12 день после заражения удалите среду из лунок и осторожно промойте их фосфатно-солевым буферным раствором. Затем окрасьте одним миллилитром раствора кристаллического фиолетового при комнатной температуре в течение двух минут. После окрашивания аккуратно промойте фосфатно-солевым буферным раствором дважды. Под микроскопом подсчитайте общее количество синих колоний в каждой лунке.

Высейте клетки 32D-G-CSF-R в шестилуночный планшет. Добавьте вирус с множественностью заражения от 10 до 40. Затем добавьте к клеткам полибрен до конечной концентрации 8 µg/mL и инкубируйте при 37 °C в течение шести часов. После инкубации соберите клетки в пробирку объемом 15 mL и центрифугируйте при 450 ×g в течение пяти минут при 4 °C. Клетки 32D могут частично утратить способность к дифференцировке при достижении концентрации более 1 × 10⁶ клеток/мл, поэтому крайне важно своевременно пересевать эти клетки и не допускать избыточного разрастания культур.

Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в культуральном флаконе T25, содержащем шесть миллилитров среды RPMI-1640 с добавлением 10% термоинактивированной фетальной сыворотки бычьего происхождения и 10 нанограммов на миллилитр мышиного интерлейкина-3. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 48 часов.

Дважды промойте клетки 32D-G-CSF-R средой RPMI-1640 без цитокинов. Затем в день 0 высейте клетки в одном миллилитре дифференцировочной среды в 24-луночный планшет и инкубируйте при 37 °C в течение ночи. Дифференцировка клеток в зрелые гранулоциты займет от семи до девяти дней. После этого подсчитайте количество клеток, используя трипановый синий для исключения погибших клеток.

Поскольку IL-3 может ингибировать процесс дифференцировки, крайне важно удалить все следы этого цитокина перед культивированием клеток в GCSF.

Проведите цитоспинирование клеток на предметное стекло в центрифуге с соответствующими адаптерами при 20 ×g в течение пяти минут. Затем зафиксируйте клетки в метаноле в течение пяти минут при комнатной температуре и дайте им высохнуть. Окрасьте клетки методом Май-Грюнвальда-Гимзы согласно протоколу производителя. После окрашивания визуализируйте окрашенные клетки при 40-кратном увеличении.

На основании клеточной морфологии количественно определите число бластов, промежуточно дифференцированных клеток и зрелых гранулоцитов среди окрашенных клеток.

Здесь представлено графическое изображение, демонстрирующее пролиферацию клеток 32D-G-CSF-R в средах, содержащих интерлейкин-3 и фактор стимуляции колоний гранулоцитов. Ось x представляет дни обработки, ось y представляет количество клеток в логарифмическом масштабе. Черный график показывает пролиферацию при культивировании клеток в среде, содержащей интерлейкин-3. Синий график показывает снижение пролиферации клеток при культивировании в среде, содержащей фактор стимуляции колоний гранулоцитов.

Здесь представлены репрезентативные круговые диаграммы и результаты окрашивания по методу Май-Грюнвальда-Гимзы, демонстрирующие пропорцию и морфологию дифференцировки клеток 32D-G-CSF-R в среде, содержащей фактор стимуляции колоний гранулоцитов. Круговые диаграммы показывают долю бластов, промежуточно дифференцированных клеток и нейтрофилов при воздействии фактора стимуляции колоний гранулоцитов в нулевой, второй, четвертый и шестой дни. Клетки, окрашенные по методу Гимзы в нулевой день, имеют характерные крупные ядра и темную цитоплазму. На шестой день размер ядер уменьшается, а цитоплазма увеличивается, но перестает быть темной.

Здесь представлены репрезентативные круговые диаграммы, демонстрирующие более высокую доля бластных клеток при трансдукции сливными белками BCR-ABL по сравнению с контрольным вектором MSCV в среде, содержащей гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Окрашивание по Гимзе на нижней панели является репрезентативным для клеток, трансдуцированных контрольными или сливными белками BCR-ABL.

К шестому дню клетки, трансдуцированные контрольным вектором MSCV, подверглись нейтрофильной дифференцировке, в то время как в клетках, трансдуцированных BCR-ABL, преобладали бласты и отсутствовали зрелые нейтрофилы.

После освоения эта методика может быть выполнена за два дня при условии правильного соблюдения всех этапов. При проведении данной процедуры важно помнить о необходимости культивирования клеток 32D с рецепторами G-CSF в указанных концентрациях. После выполнения этой процедуры для поиска ответов на дополнительные вопросы могут быть применены другие методы, такие как анализы миграции и эксперименты по выживаемости. Посмотрев это видео, вы должны получить четкое представление о работе с клеточной линией 32D с рецепторами G-CSF, включая генетические манипуляции посредством лентивирусной и ретровирусной трансдукции, экспансию, дифференцировку, а также оценку пролиферации и дифференцировки этих клеток. Не забывайте, что работа с вирусами может быть опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и защитных очков.