Промежуток времени, метки бесплатно, количественные фаза изображений исследования активных и неактивных человеческих раковых клеток

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы количественно охарактеризовать ангиогенные и неангиогенные фенотипы клеток остеосаркомы человека на систематической основе, сочетая анализ морфологии, пролиферации и подвижности клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся развития и прогрессирования рака у человека. В частности, выход из опухолевого покоя и эндогенное переключение.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что многоклеточные параметры могут быть проанализированы одновременно с помощью этого интегрированного метода с высоким разбросом. Это включает в себя площадь клеток, толщину клеток, объем клеток, скорость пролиферации, время удвоения, скорость подвижности, миграцию и подвижность. Для начала предварительно прогрейте культуру средой до 37 градусов Цельсия на водяной бане.

Затем извлеките из резервуара с жидким азотом криогенные флаконы ангиогенных и неангиогенных клеток остеосаркомы человека. Погрузите дно флаконов в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия и осторожно встряхните криогенные флаконы, чтобы ускорить процесс размораживания. Как только ячейки разморозятся, распылите на флакон 70% этанола и протрите флакон, чтобы стерилизовать его.

Затем немедленно отсадите клеточную суспензию из флакона и аккуратно суспензируйте их в 10 миллилитрах подогретой питательной среды. Затем центрифугируйте клеточные суспензии в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки. Вернувшись в капот, снимите надосадочную жидкость и повторно суспензируйте клеточную гранулу 10 миллилитрами подогретой питательной среды.

Затем переложите клеточную суспензию в колбу Т75. Аккуратно пипеткой несколько раз нанесите клеточную суспензию, чтобы равномерно распределить клетки. Поместите колбу в инкубатор и дайте ячейкам прикрепиться не менее 12 часов.

Меняйте питательную среду каждые два-три дня. Когда клетки достигнут 80-100-процентного слияния, удалите питательную среду из колбы и промойте клетки пятью миллилитрами стерильного PBS без кальция и магния. Затем добавьте в колбу один миллилитр 0,25%-ного раствора трипсона ЭДТА и кратковременно перемешайте колбу.

Инкубируйте колбу в течение двух-трех минут, а затем проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки округлены и отделены. После того, как клетки будут отделены, с помощью пипетки добавьте 10 миллилитров питательной среды и осторожно пипетируйте среду вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить любые оставшиеся клеточные агрегаты. Подсчитав клетки, посадите два миллиона из них в новую колбу T75.

Поместите колбу в инкубатор и вырастите клетки до 80-100-процентного слияния, прежде чем засевать клетки для эксперимента количественной фазовой визуализации. Сбор клеток методом трипсоновского разложения и посев ангиогенных и неангиогенных клеток остеосаркомы человека в шестилуночные планшеты с плотностью от 50 000 до 300 000 клеток на лунку. Накройте клетки в общей сложности пятью миллилитрами питательной среды.

Затем инкубируйте планшеты не менее 12 часов, чтобы дать время для прикрепления клеток. Перед визуализацией замените носитель свежим носителем. Очистите чехол, промыв его несколько раз проточной деионизированной водой.

Затем погрузите его в раствор 75% этанола на 15 минут. Поместите стерилизованную крышку в ламинарный колпак для просушки. Далее осторожно поместите крышку листа в шестилуночную пластину, не допуская явных пузырей.

Поместите тарелку в инкубатор для равновесия не менее чем на 15 минут. Если на крышке пластины образуется туман, протрите ее стерильной ватной палочкой перед визуализацией. Откройте программное обеспечение для количественной фазовой визуализации и инициализируйте систему.

Убедитесь, что значения приемлемы при самокалибровке времени экспозиции, контраста узора и шума голограммы. Затем поместите шестилуночный планшет на столик количественного фазового микроскопа. Вернувшись в программу, нажмите на «Захват в реальном времени».

Затем перейдите в меню фокусировки программного обеспечения и выберите «Ручной». Далее перейдите в меню настроек микроскопа и грубо сфокусируйте фазовые изображения клеток, регулируя рабочее расстояние для получения контуров клеток на фазовых изображениях. По завершении вернитесь в меню фокусировки программного обеспечения и измените настройку фокусировки на автоматическую.

Теперь нажмите на новый эксперимент. Начните выбор позиций для получения изображения с помощью мыши или клавиш со стрелками на цифровой клавиатуре. Нажимайте кнопку «Запомнить» после каждого выбора.

После того, как все позиции выбраны, перейдите в раздел покадровой съемки и настройте интервалы визуализации так, чтобы они были короче пяти минут, а общий период времени составлял 48 часов. Запустите эксперимент, нажав кнопку «Захват». Это позволит автоматически фокусироваться и получать изображения в выбранных положениях в каждом интервале временных точек.

После получения изображения проанализируйте морфологию клеток, сначала щелкнув по кнопке «Идентифицировать клетки». Настройте числовое значение порогового значения фона таким образом, чтобы области ячеек были хорошо отделены от фонового шума. Затем отрегулируйте значение размера объекта, чтобы убедиться, что каждая клетка имеет только одно ядро.

Вручную измените все сегменты ячеек, не соответствующие этому требованию, с помощью ручных изменений. Затем используйте функцию анализа данных в программном обеспечении для анализа ячеек. Начните новый анализ данных, нажав кнопку Новый анализ.

Перетащите выбранные изображения на вкладку исходных кадров и запишите параметры морфологии ячейки, включая площадь ячейки, оптическую толщину и объем для каждой отдельной ячейки. По завершении выберите режим точечной диаграммы или гистограммы и экспортируйте данные в виде таблиц или рисунков. Выберите не менее пяти изображений с интервалом в 12 часов и запишите номера ячеек, предоставленные программным обеспечением.

Оцените скорость пролиферации клеток, нормализовав их с помощью исходных номеров клеток, а затем построите график их номеров. Наконец, оцените время удвоения, подогнав точки данных с помощью кривой экспоненциального роста. Для анализа движения ячеек используйте функцию отслеживания ячеек в программном обеспечении.

Начните с нажатия на кнопку «Новый анализ», чтобы начать новый анализ данных. Затем перетащите серию изображений из интересующего вас периода времени на вкладку исходных кадров. Далее, в режиме выделения добавить ячейки, случайным образом выберите от 10 до 30 ячеек, кликнув по ним.

Обязательно просмотрите трекинг в серии снимков. В случае, если система теряет след ячейки или отслеживает неправильную ячейку, вручную настройте ячейку отслеживания, нажав на кнопку «Идентифицировать» для идентификации ячеек или перейдя в режим выбора и нажав на кнопку «Изменить местоположение», чтобы изменить местоположение ячейки. Когда закончите, перейдите к графику движения и выберите строки, график траекторий ячеек или перейдите к построению графика особенностей и построения графика для других параметров, связанных с движением, таких как подвижность, скорость, подвижность, миграция и прямота миграции.

Экспортируйте данные в виде таблиц или рисунков. В этом протоколе количественные фазовые изображения представлены в виде голограмм. Показанные здесь клетки отображают типичную клеточную морфологию ангиогенных и неангиогенных клеток остеосаркомы человека.

Толщина ячейки рассчитывается по показателю преломления и длине оптического пути и показана здесь в виде диаграммы рассеяния. Два разностных типа феноклеток демонстрируют разные паттерны распределения и указывают на то, что ангиогенные клетки имеют меньшую площадь и большую толщину клеток, чем неангиогенные клетки. Скорость пролиферации двух типов клеток может быть рассчитана на основе двухмерных изображений, подобных этим, которые были сегментированы и охватывают течение двух дней.

Для этих конкретных типов клеток не было обнаружено существенных различий. Чтобы определить характеристики движения клеток для клеток, необходимо выбрать отдельные клетки и отслеживать их с течением времени. Здесь отслеживаемые ячейки обведены разными цветами.

Каждая отдельная клетка отслеживалась в течение четырех часов, и здесь описана их общая траектория, где ноль, нулевая точка — это их начальное местоположение, а их конечное местоположение обозначено цветной точкой. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать количественную фазовую визуализацию для количественного сравнения морфологических и поведенческих параметров клетки. В данном случае между ангиогенными и неангиогенными фенотипами клеток.

После этой разработки этот метод проложил путь для исследователей в области исследований рака для изучения выхода из опухолевого покоя и роли ангиогенезии в этом процессе. В непрерывной платформе, не требующей маркировки. Не забывайте, что работа с клеточными линиями человека может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты.