Комбинационный лечения трихостатин А и витамин С улучшает эффективность клонирования мышей путем переноса ядер соматических клеток

Общая цель этого эксперимента заключается в повышении эффективности производства реконструированных эмбрионов и клонированных мышей с использованием переноса ядра соматических клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области фундаментальной биологии, биологии развития и спасения исчезающих животных. Например, эмбриональное развитие, ядерное программирование и сохранение генетических исследований.

Основное преимущество этого метода и техники заключается в том, что с помощью простых процедур можно получить клонированных мышей с практическим уровнем эффективности. После приготовления питательной среды согласно текстовому протоколу растворить 1,2 грамма БСА в 10 мл стерильной воды комнатной температуры. Добавьте примерно 0,12 грамма гранул смешанной ионообменной смолы в раствор BSA при комнатной температуре при осторожном перемешивании.

Когда бусины изменят цвет с сине-зеленого на золотой, используйте пипетку для восстановления раствора надосадочной жидкости, а затем замените бусины свежей партией. Убедившись, что свежие бусины не меняют цвет, восстановите раствор. Затем добавьте 250 микролитров 10,5% гидрокарбоната натрия.

С помощью фильтра 0,45 микрона простерилизуйте надосадочную жидкость, затем пометьте ее как стоковый раствор DBSA и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия. После проведения эвтаназии самкам мышей, подвергнутым суперовуляции согласно текстовому протоколу, использовали стандартные методики диссекции для разреза брюшной полости для доступа к репродуктивным путям. С помощью небольших прямых ножниц и пинцета вырежьте яйцеводы и перенесите их на лист фильтровальной бумаги, чтобы стереть кровь с поверхности.

Далее поместите яйцеводы в минеральное масло, затем с помощью игл для рассечения ампулы яйцевода и переместите идущие из ампулы комплексы ооцитов в 200 микролитровых каплях среды HCZB с 0,1% гиалуронидазы. Выдержите ткань на согревающей тарелке в течение пяти минут. Под стереомикроскопом подтвердить, что кучевые клетки высвобождаются из комплексов кучевых ооцитов, затем перенести вторые мейотические или М2-метафазные ооциты с некоторыми оставшимися кумулюсными клетками в среду MKSOM, содержащую 0,3% DBSA.

Промывайте ооциты стадии М2 четыре раза, пипетируя вверх и вниз в среде, чтобы отделить оставшиеся кучевые клетки. Затем инкубируйте ооциты в среде при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до энуклеации. Для выделения оголенных ооцитов из кумулюсных комплексов ооцитов под стереомикроскопом с помощью пипетки переносят небольшое количество оставшихся кучевых клеток, диспергированных из кучевых комплексов ооцитов, в среду HCZB с 6% DBSA.

Поместите кумулюсные клетки на нагревательную пластину при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся для переноса ядра соматической клетки или SCNT. После приготовления среды ПВП и стоковых растворов СВ в соответствии с текстовым протоколом для промывания ооцитов стадии М2 используйте стерилизованную пипетку с 20 микролитрами среды HCZB, содержащей пять микрограммов на миллилитр КБ. Повторив промывание пять раз, инкубируйте ооциты в растворе для энуклеации на нагревательной пластине в течение 10 минут.

Затем подготовьте камеру энуклеации, затем с помощью пипетки перенесите ооциты M2 в камеру. Добавьте четыре микролитра раствора для энуклеации и залейте камеру минеральным маслом. Под микроскопом при комнатной температуре определите веретена и хромосомы ооцита стадии М2

Затем с помощью удерживающей пипетки и микропипетки ориентируйте ооцит с выраженным первым полярным тельцем так, чтобы расположение веретена и хромосомы было в положении 3:00 или 9:00. Установите интенсивность импульса пайзо от трех до шести, и с помощью микроманипуляционной пипетки просверлите зону пеллюциды и откройте в ней отверстие. Затем с минимальным количеством цитоплазмы полностью энуклеируют веретена и хромосомы.

Под действием видимого света подтвердить отсутствие хромосом в цитоплазме, затем средой MKSOM, содержащей 0,3% DBSA, в которой отсутствует CB, тщательно промыть энуклеированные ооциты. Инкубируйте чашку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до слияния клеток. Чтобы приготовить HBJE, добавьте 260 микролитров ледяного раствора суспензии HBJE в лиофилизированный HVJ-E и пипетируйте вверх и вниз до полной суспензии.

Приготовьте пять микролитров аликвот раствора и храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия до слияния клеток. Чтобы провести слияние клеток, используйте 20 микролитров буфера для слияния клеток, чтобы разбавить пять микролитров раствора HVJ-E. Разбавленный раствор HBJE поместить на лед до использования.

После подготовки камеры слияния клеток, как показано здесь, с помощью пипетки перенесите энуклеированные ооциты в среду HCZB в камере. Добавьте по четыре микролитра каждого раствора, как показано на рисунке, и используйте примерно один миллилитр минерального масла, чтобы покрыть камеру. Поместите камеру с энуклеированными ооцитами при комнатной температуре под микроскоп с 400-кратным увеличением.

Затем с помощью пипетки для микроманипуляций перенесите донорские клетки в раствор суспензии HVJ-E. Отсасывайте кумулюсные клетки одну за другой, чтобы равномерно отделить их друг от друга, обеспечивая последовательное слияние клеток. Затем с помощью удерживающей пипетки удерживайте энуклеированные ооциты в среде HCZB и используйте импульс пайзо с пипеткой для микроманипуляций для сверления пеллюцидной зоны.

После открытия отверстия в zona pellucida пипеткой нажмите кумулюсную клетку объемом примерно в пять раз больше раствора HVJ-E и плотно втолкните ее в мембрану ооцита, не проходя через мембрану. После манипуляций со слиянием клеток немедленно перенесите ооциты в среду MKSOM, содержащую 0,3% DBSA, и переместите их в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на один час. Последующие этапы должны быть выполнены в течение 10 минут от помещения энуклеированных ооцитов в среду HCVB под микроскопом до их возвращения в инкубатор.

После слияния клеток под микроскопом при 400-кратном увеличении проверяют преждевременную конденсацию хромосом в реконструированных ооцитах. Перенесите реконструированные ооциты в активационную среду, содержащую трихостатин А, или TSA, и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на воздухе в течение шести часов. Наблюдайте за формированием пронуклеусов у эмбрионов SENT, затем примените еще два часа обработки TSA в среде MKSOM с 0,3% TBSA.

Проводят лечение витамином С согласно текстовому протоколу. Как видно из этой таблицы, лечение TSA и витамином С на клонированных ооцитах мышей показало очень высокую скорость образования пронуклеаров и развилось до двухклеточной стадии при любых условиях. Некоторые клонированные эмбрионы, которые были получены из кумулюсных клеток и развились до двухклеточной стадии, были перенесены в яйцеводы псевдобеременных самок.

На этом рисунке показано шесть клонированных потомков, которые развились из 72 перенесенных эмбрионов, полученных от трех беременных самок путем серийного лечения TSA и витамином С. Наконец, как показано здесь, лечение TSA и VC значительно повысило эффективность эмбрионального развития in vitro до стадии бластоцисты. Приступая к этой процедуре, важно помнить, что все необходимые среды и реагенты подготовлены заранее. Сама по себе процедура, простые в исполнении и хорошо подготовленные материалы обеспечат достижение ожидаемых результатов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как производить реконструированные ооциты.