В естественных условиях Blood - brain барьер проницаемость Assay мышей с использованием дневно помечены Трейсеры

Здесь мы представляем пробирного сосудистой проницаемости мозга мыши, используя внутрибрюшинного введения флуоресцентных Трейсеры следуют перфузии, которая применима к Животные модели blood - brain барьер дисфункции. Один hemi мозг используется для количественной оценки проницаемость и другой для трассировочного визуализации/иммуноокрашивания. Процедура занимает 5-6 ч для 10 мышей.

Общая цель этой процедуры заключается в оценке проницаемости сосудистой сети головного мозга у мышей с использованием флуоресцентно меченных индикаторов для оценки дисфункции гематоэнцефалического барьера на животных моделях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гематоэнцефалического барьера, касающиеся проницаемости нервно-сосудистых систем при заболеваниях и ее восстановления после терапии. Главное преимущество этого метода в том, что он прост и количественен.

Это дает возможность одновременной оценки проницаемости методом флуориметрии, которая носит количественный характер, а также флуоресцентной микроскопии для региональных защит. Применение этого метода распространяется на диагностику и терапию нескольких неврологических расстройств, включая опухоли головного мозга, инсульт и болезнь Альцгеймера, поскольку эти заболевания связаны с опасным для жизни отеком мозга и улучшением функции BBD в качестве ключевой терапевтической мишени. Часть процедуры будет демонстрировать мисс Ядранка Макас, сотрудник по научным технологиям в институте.

Внутрибрюшинно вводят мышам 100 микролитров двухмиллимолярного раствора индикатора. Выбирайте фиксируемые лизин индикаторы, такие как декстраны, помеченные FITC и TMR с четкими спектрами излучения возбуждения, для минимизации интерференции между красителями. При комбинировании индикаторов введите 200 микролитров раствора комбинированных индикаторов внутрибрюшинно.

Включите инъекции, предназначенные только для автомобиля, в качестве фиктивных элементов управления для вычитания автофлуоресцентного фона. После каждой инъекции подождите пять минут, прежде чем глубоко обезболить мышей в соответствии с утвержденными протоколами учреждения. Подготовьте животных к сердечной перфузии через 10 минут после введения анестетика.

Проверьте отсутствие реакции подергивания лапы, чтобы убедиться, что мышь достигла хирургической плоскости анестезии. Положите перфузирующую мышь на спину и нанесите 80% этанол на кожу области живота. С помощью маленьких ножниц создать двухсантиметровый разрез в брюшной стенке, отделить печень от диафрагмы, а затем медленно разрезать диафрагму, обнажив множественную полость.

Разрежьте грудную клетку с двух сторон и зафиксируйте разрезанную грудину, чтобы обнажить левый желудочек. Введите иглу-бабочку 21-го калибра, соединенную с перистальтической перфузионной системой в задней части левого желудочка. Проколите правое предсердие, а затем с помощью одномиллилитрового наконечника пипетки с отрезанным концом быстро соберите от 200 до 300 микролитров выделившейся крови и перенесите его в пробирку для сбора сыворотки.

Храните собранную кровь на льду. Как только кровь будет собрана, включите систему перфузии и перфузируйте животное в течение трех минут кальцием комнатной температуры и магнием PBS, не содержащим ионов ионов. Оцените качество перфузии, обратив внимание на цвет печени и почек, которые кажутся бледными после перфузии.

После забора материала из головного мозга убедитесь, что в сосудах мозговых оболочек не видно крови. Образец должен быть исключен из анализа проницаемости, если качество перфузии оставляет желать лучшего. С помощью скальпеля разделите мозг на два полумозга.

Затем рассекают мозжечок и обонятельную долю из одного полумозга, а геми-мозг переносят в двухмиллилитровую трубку. Поместите одну собранную почку в другую двухмиллилитровую трубку. Сразу же поместите образцы на сухой лед.

Нативно встраиваем оставшуюся почку и полумозг с мозжечком и обонятельными долями в неповрежденный состав TissueTech для оптимальной температуры резки и помещаем его на сухой лед. Наконец, после центрифугирования образцов крови при 10 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, перенесите надосадочную жидкость сыворотки в пробирки объемом 1,5 миллилитра и поместите их в контейнер для сухого льда. Перенесите образцы в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия по мере увеличения эффективности гомогенизации после замораживания-размораживания.

Поместите образцы геми-мозга и почек на лед для оттаивания, а затем взвесьте пробирки, содержащие органы. Из этих весов вычтите среднее значение примерно 20 пустых трубок, чтобы получить вес ткани. Добавьте 300 микролитров холодного PBS в пробирку, содержащую почку, и 200 микролитров в пробирки, содержащие геми-мозг.

Гомогенизируйте каждый образец в исходной пробирке для микрофуги с помощью пестика из ПТФЭ, прикрепленного к электрической верхней мешалке, используя около 15 ходов. Храните гомогенизированные образцы на льду, защищенном от света. Промойте пестик PBS между образцами и вытрите насухо, прежде чем переходить к следующему образцу.

Когда все образцы будут гомогенизированы, центрифугируйте в течение 20 минут при температуре 15 000 G и четырех градусах Цельсия. После центрифугирования переложите надосадочную жидкость в новые 1,5-миллилитровые пробирки на льду, прежде чем приступить к измерению флуоресценции и количественному оценке. Перенесите надосадочную жидкость на 384-луночный планшет и вставьте планшет в считыватель флуоресценции.

Убедитесь, что для трассера включены правильные длины волн возбуждения и излучения, и установите коэффициент усиления на оптимальное. Начните измерение и экспортируйте данные в виде электронной таблицы для выполнения расчетов, как описано в протоколе. В день окрашивания разморозьте 10-микронные срезы криостата, установленные на предметных стеклах, при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Затем зафиксируйте срезы 4%-ным параформальдегидом на 10 минут при комнатной температуре с последующей быстрой промывкой в PBS. Пермеабилизацию и блокирование неспецифического связывания в срезах путем инкубации в стерильных PBS, содержащих 1% ПСА и 0,5% Triton X-100, в течение одного часа при комнатной температуре. После блокировки инкубируйте предметные стекла с разведением первичного антитела к CD31 в соотношении от 1 до 100 в течение 1,5 часов при комнатной температуре.

После промывки PBS три раза по пять минут каждый проведите вторичную инкубацию антител в течение одного часа при комнатной температуре с видоспецифичными флуоресцентно меченными антителами. Закрепите окрашенные участки с помощью Aqua-Poly/Mount и оставьте на ночь для полимеризации при комнатной температуре в темноте. Наконец, получение изображений с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа со спектральной визуализацией.

Для того чтобы установить время циркуляции индикатора для анализа проницаемости, длительное время циркуляции сравнивают с коротким временем циркуляции в 15 минут после введения индикатора. Более длительное время циркуляции в два часа приводит к низкому накоплению индикаторов в почках по сравнению с коротким 15-минутным временем циркуляции, возможно, из-за высокого клиренса декстрана FITC, показанного зеленым цветом из сосудистого компартмента. Этот эффект еще более драматичен в мозге из-за плотного гематоэнцефалического барьера.

Окрашивание CD31, наблюдаемое в красном канале, подтвердило наличие сосудов в почках в обеих исследуемых точках времени и в головном мозге. После освоения этой техники она может быть выполнена в течение пяти-шести часов на 10 мышах с двумя учеными, работающими в тандеме. При использовании этого метода важно помнить об использовании индикаторов правильной молекулярной массы, диаграммы и флуоресцентных характеристик, чтобы ответить на вопросы о проницаемости гематоэнцефалического барьера.

После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как иммуногистохимия для BBD и заполнение факторов заболевания, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как тяжесть и локализация очага заболевания.