Генетическая инженерия первичных маучек кишечных органоидов использование магнитных наночастиц Трансдукции Вирусные векторы для замороженных секций
10 мая 2019 г.
Мы описываем пошаговые инструкции: 1) эффективно инженер кишечных органоидов с помощью магнитных наночастиц для ленти- или ретровирусной трансдукции, и, 2) генерировать замороженные секции из инженерных органоидов. Этот подход является мощным инструментом для эффективного изменения экспрессии генов в органоидах для исследования эффектов ниже по течению.
Поскольку органоиды подысовывают родную структурную организацию, а также многие молекулярные особенности кишечного эпителия in vivo, этот метод позволяет изучать нормальную биологию и состояния заболеваний в лаборатории. Основным преимуществом этого метода является способность генетически инженер органоидов с использованием очень высокоэффективного подхода к трансдукции с низкой цитотоксичности, что позволяет для функциональных исследований этих генетически манипулируемых органоидов. Последствия этого метода распространяются на терапию кишечных заболеваний, потому что мы можем подвергать кишечных органоидов наркотиков и других агентов или мероприятий.
Этот метод может быть применен для изучения развития и патологических процессов в других системах, подложных органоидным культурам, таким как ткани молочной железы или для клеток, растущих в стандартных 2D условиях. Как правило, лица, новые для этого метода будет успешным с трансдукции в трудно-инженер органоидов или других клеток. Впервые у нас возникла идея этого метода, когда мы столкнулись с трудностями при трансдуцировании наших органоидов и стволовых клеток.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как структурная потеря органоидов может произойти, если образцы не должным образом обработаны во время встраивания процесса в подвале матрицы для криозирования. Выращивать органоиды для вирусной трансдукции, культуры семенных органоидных клеток с 200 микролитров трансдукционной среды на колодец в 48-колодец пластины, и инкубировать в стандартной культуре тканей инкубатора. Оттепель флаконы вируса для трансдукции, что позволяет около 50 микролитров концентрированного вируса для трансдукции каждой из них в 48-хорошо пластин.
В 1,5-миллилитровой трубке смешайте вирус с 12 микролитровами раствора магнитных наночастиц и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут. Через 15 минут добавьте магнитный раствор наночастиц и вирусную смесь в клетки для индуцированных. Поместите 48-хорошо пластины на магнитной пластине, и инкубировать в стандартной культуры ткани инкубатор, по крайней мере два часа.
Когда вирусная трансфекция будет завершена, перенесите инфицированные органоидные клеточные кластеры и трансдукционную среду из каждого колодец в 1,5-миллилитровую трубку. Центрифуга по 500 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта с нежным всасыванием и охладьте трубки, содержащие гранулы на льду в течение пяти минут.
Добавьте 120 микролитров мембранной матрицы подвала к каждой трубке и повторно посовелите гранулы, медленно трубя вверх и вниз. Семенные 30-микролитровые капли матрично-клеточной смеси в новую пластину из 48 колодец. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение пяти-пяти минут, пока матрица не затвердеет.
Добавьте трансдукционную среду к каждой хорошо, и инкубировать в стандартном инкубаторе культуры тканей в течение трех-четырех дней. Через три-четыре дня проинспектировать культуры под световым микроскопом при 10-м увеличении, чтобы обеспечить организацию клеточных кластеров в органоидные структуры. Аккуратно замените трансдукционную среду в каждой хорошо с 250 микролитров органоидной культуры ENR среды.
Верните тарелку в инкубатор. Начните эту процедуру, удалив enR среды нежным всасывания, будьте осторожны, чтобы не возмущать матрицы мембраны подвала. Аккуратно промыть 500 микролитров PBS.
Исправить органоиды, добавив один микролитер 4%параформальдегид раствор на колодец, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Через 30 минут удалите раствор параформальдегида путем всасывания. Аккуратно добавьте один микролитер PBS на колодец, а затем удалите PBS нежным всасыванием.
Таким образом, мыть дважды с PBS. Удалите PBS из второй стирки, и добавить один микролитер 30% сахарозы буфера для каждого образца. Инкубировать фиксированные органоиды в сахарозе в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию, чтобы обезвоживать образцы.
Удалите буфер сахарозы путем всасывания, и добавить достаточно встраивания соединения для покрытия матричного слоя в каждой хорошо. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем поместите образцы в морозильную камеру по температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 10 минут или до тех пор, пока встраивающий соединение не станет твердым и белым.
Поместите пластину с замороженным встраиваемым соединением при комнатной температуре, чтобы обеспечить минимальное таяние соединения по краям. Используйте скальпель или шпатель, чтобы отделить блок от стенок колодеца. Работайте быстро, чтобы предотвратить таяние, используя типсы, чтобы удалить матрицу встраивания соединения блока, и поместить его в блок образца.
Заполните форму полностью с встраиванием соединения. Заморозить при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 30 минут, прежде чем использовать блок для секций. Этот протокол был оптимизирован путем первой трансдуцирования кишечных органоидов с лентивирусными векторами, связанными с GFP.
GFP был визуализированы на каждом этапе развития органоидов, в том числе на раннем этапе, когда крипто-клетки организовать в кисты, как структуры или на более поздних точках времени, когда органоиды образуют почки. Успешно транс индуцированные кишечные органоиды были затем формалин-фиксированной, криозекции, и проанализированы с помощью иммунофлуоресценции изображений. На этом изображении ядра окрашены в синий цвет, а зеленый цвет указывает на молекулы адгезии эпителиальных клеток, которые демаркирует границы клеток.
Красный цвет указывает на лизосом окрашивание для идентификации клеток Панета. После освоения, трансдуцирования органоидов может быть выполнена примерно за три часа, и органоиды крисекции встраивания может быть сделано примерно в 2 1 / 2 часа. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы работать на льду при обработке подвала матричных реагентов.
После завершения этой процедуры, иммунофлуоресцентный анализ и другие методы для обнаружения белков или органелл могут быть выполнены для оценки локализации или относительного изобилия. Этот метод прокладывает путь для исследователей, чтобы исследовать нормальную биологию и болезни государств в пробирке, а также для виво исследований, если транс индуцированных органоидов или клеток могут быть имплантированы в мышей. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как использовать магнитно помечены вирусы генетически инженер органоидов для криозирования.
Пожалуйста, не забывайте, что работа с вирусами может быть чрезвычайно опасной, и такие меры предосторожности, как ношение соответствующего защитного снаряжения, всегда должны быть предприняты при выполнении этой процедуры.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод создания кишечных органоидов с использованием магнитных наночастиц для эффективной трансдукции генов. Также подробно описывается процесс приготовления замороженных срезов из этих модифицированных органоидов, что облегчает изучение экспрессии генов и ее последующих эффектов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Технология органоидов
Теоретические основы
- Органоиды имитируют структурные и молекулярные особенности кишечного эпителия in vivo.
- Данный метод позволяет изучать нормальную биологию и патологические состояния.
- Генная инженерия органоидов может быть осуществлена с низкой цитотоксичностью.
- Области применения включают воздействие лекарственных препаратов и терапевтическое вмешательство при заболеваниях кишечника.
Цель исследования
- Обеспечить надежный метод трансдукции органоидов.
- Создать возможность проведения функциональных исследований генетически модифицированных органоидов.
- Облегчить изучение процессов развития и патологических процессов.
Используемые методы
- Создание кишечных органоидов с помощью магнитных наночастиц.
- Ленти- или ретровирусная трансдукция для изменения экспрессии генов.
- Приготовление замороженных срезов из модифицированных органоидов.
- Функциональные исследования с использованием генетически модифицированных органоидов.
Основные результаты
- Продемонстрирована высокая эффективность трансдукции органоидов, трудно поддающихся генетической модификации.
- Показан низкий уровень цитотоксичности, связанный с методом трансдукции.
- Получены данные о влиянии генетических модификаций на функционирование органоидов.
- Определены потенциальные терапевтические возможности применения при заболеваниях кишечника.
Заключение
- Данный метод представляет собой мощный инструмент для изучения экспрессии генов в органоидах.
- Его можно применять к различным культурам органоидов, помимо тканей кишечника.
- В будущих исследованиях этот метод может быть использован для терапевтического вмешательства.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эффективная генетическая модификация кишечных органоидов позволяет быстро проводить функциональную оценку генных мишеней в физиологически релевантной системе, снижая зависимость от дорогостоящих и трудоемких рабочих процессов CRISPR. Данный подход способствует ранней валидации мишеней и снижению механистических рисков за счет установления связи между генетической модуляцией и фенотипическими показателями в эпителиальных структурах, имеющих значение для конкретного заболевания. Метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, сохраняя естественную архитектуру ткани и обеспечивая масштабируемую и воспроизводимая трансдукцию для последующих исследований ответа на лекарственные препараты.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает возможность быстрой проверки терапевтических гипотез за счет эффективной вирусной трансдукции кишечных органоидов с минимальной цитотоксичностью.
- Операционная ценность: сокращает временные и финансовые затраты, связанные с селекцией и скринингом с помощью CRISPR/Cas9, ускоряя сроки валидации мишеней.
- Стратегическая ценность: позволяет проводить функциональную оценку экспрессии или сайленсинга генов в компартментах стволовых клеток и крипт, повышая достоверность выбора мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать трансдукционно-компетентные органоиды, пригодные для иммуногистохимического или иммунофлуоресцентного анализа изменений экспрессии генов.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированный рабочий процесс изготовления замороженных срезов, который сохраняет морфологию ткани для последующих исследований локализации белков.
- Стратегическая ценность: обеспечивает надежную оценку соединений, позволяя проводить исследования воздействия препаратов на генетически модифицированных органоидах, имитирующих организацию эпителия in vivo.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: облегчает оценку функции кишечных стволовых клеток и крипт после генетических манипуляций, обеспечивая функциональный анализ, релевантный для изучения заболеваний.
- Практическая ценность: позволяет имплантировать трансдуцированные органоиды мышам для функционального анализа in vivo, связывая результаты in vitro с физиологической валидацией.
- Стратегическая ценность: способствует прогнозированию терапевтического ответа путем моделирования воздействия препаратов на экспрессию генов или функцию белков, а не на геномные изменения.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска путем обеспечения быстрой модуляции генов в органоидах, что способствует переходу от гипотезы о мишени к функциональной валидации до этапа идентификации соединений-лидеров.
- Открывательная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов за счет эффективной трансдукции кишечных органоидов для исследований экспрессии или сайленсинга генов.
- Скрининг: позволяет получать генетически модифицированные органоиды, готовые к анализу и сохранившие морфологию, для количественной визуализации и функционального анализа.
- Аналитика: обеспечивает количественную оценку молекул эпителиальной адгезии, лизосомальных маркеров и окрашивание ядер с помощью иммунофлуоресценции для анализа эффективности трансдукции и клеточных фенотипов.
- Трансляционные исследования: связывает инженерию органоидов in vitro с исследованиями in vivo посредством имплантации трансдуцированных органоидов мышам для функционального анализа.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для генетических манипуляций с кишечными и другими эпителиальными органоидами для работы с различными мишенями и проведения кампаний по скринингу лекарственных средств.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов путем установления связи между генетическими модификациями и функциональными результатами в эпителиальной системе, релевантной для данного заболевания.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость за счет трансдукции с помощью магнитных наночастиц и стандартизированного криосекционирования.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшего продолжения исследований (go/no-go), снижая механистическую неопределенность при валидации мишеней посредством экспресс-оценки фенотипа.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе функционального отклика органоидов на генетические и фармакологические воздействия.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами органоидов, вирусами и подготовкой магнитных наночастиц.
- Необходим доступ к магнитным планшетам, криостату и оборудованию для иммунофлуоресцентной визуализации.
- Требуется стандартизированное обучение для предотвращения потери структурной целостности на этапах заливки и изготовления срезов.
- Необходима оптимизация для различных типов органоидов и серотипов вирусов для достижения стабильной эффективности трансдукции.
- В связи с использованием вирусных векторов требуются меры биологической безопасности, включая использование СИЗ и соблюдение протоколов локализации.
