Кинетический анализ Vasculogenesis дает количественную оценку динамики Vasculogenesis и ангиогенеза в пробирке

Общая цель этого экспериментального метода заключается в визуализации и количественной оценке динамического процесса васкулогенеза с течением времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ангиогенеза и васкулогенеза о скоростях формирования сосудов и различиях между структурными паттернами сформированной сети. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она позволяет количественно оценить большое количество временных точек васкулогенеза, что дает возможность оценить кинетику васкулогенного процесса.

Этот метод может быть применен к любой клеточной популяции или патологическому состоянию, которое влияет на процессы васкулогенеза или ангиогенеза, для изучения отдельных клеточных популяций или систем совместного культивирования. Примерно за один-два часа до начала эксперимента разогрейте микроскоп до 37 градусов Цельсия и установите углекислый газ на 5% и влажность на 85%. Поместите камеру живых клеток на микроскоп, а затем поместите пустое предметное стекло в одно из двух открытых мест в камере живых клеток.

Наполните предметное стекло дистиллированной водой и установите вторичную воздуходувку на температуру от 39 до 42 градусов Цельсия, чтобы нагреть предметные стекла снизу и свести к минимуму образование конденсата. Поддержание надлежащей температуры и влажности в камере визуализации живых клеток имеет решающее значение для успеха эксперимента. Добавьте второй слайд в качестве пустого, пока не будет добавлен экспериментальный слайд.

Затем добавьте воду в резервуары, окружающие скважины на втором слайде, чтобы имитировать условия во время эксперимента по визуализации. Чтобы загрузить предметное стекло экспериментальной камеры с матрицей базальной мембраны, сначала загрузите пипетку объемом 20 микролитров с холодным наконечником пипетки объемом 20 микролитров и с помощью ножниц отрежьте примерно один сантиметр от конца наконечника. Установите объем пипетки на значение, чуть превышающее 10 микролитров, и медленно вдавливайте матрицу в модифицированный наконечник пипетки.

Немедленно поместите наконечник пипетки в центр одного предметного колодца, осторожно касаясь наконечником дна лунки, и медленно нажмите на поршень, чтобы вытолкнуть матрицу. После добавления матрицы во все 15 лунок надавите крышкой до упора на предметное стекло. Точное и последовательное пипетирование объемов Матригеля в каждую лунку имеет решающее значение для получения высококачественных фазово-контрастных изображений.

Затем поместите предметное стекло при температуре 37 градусов Цельсия на 30-60 минут рядом с 50-миллилитровой конической крышкой пробирки, наполненной двумя-тремя миллилитрами PBS, чтобы уменьшить обезвоживание матрицы. Когда матрица затвердеет, удалите надосадочную жидкость из культивируемой за ночь культуры эндотелиальных колониеобразующих клеток и промойте клетки семью миллилитрами PBS. Аспирируйте PBS и отделите клетки двумя-тремя миллилитрами трипсина при температуре 37 градусов Цельсия на две-пять минут.

Затем ресуспендируйте диссоциированные клетки в трех миллилитрах эндотелиальной среды для роста-2, чтобы разрушить любые клеточные сгустки и перенесите полученную клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров. После того, как все образцы эндотелиальных колониеобразующих клеток были ресуспендированы, гранулируйте клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы в одном-двух миллилитрах свежей эндотелиальной питательной среды. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток в каждом образце и добавьте достаточное количество эндотелиальных колониеобразующих клеток в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра, чтобы обеспечить разведение клеток в соотношении от 1,4 до 10-4 клеток на 175 микролитров средней концентрации.

Затем смешайте каждую мастер-смесь с помощью аккуратного пипетирования. Снимите крышку и выложите 50 микролитров каждой мастер-смеси на лунку в трех экземплярах на предметное стекло. Чтобы получить изображение клеток, замените пустое предметное стекло одним экспериментальным предметным стеклом и добавьте воду в резервуары, окружающие клетки на предметном стекле

Циклически пройдитесь по каждой ступени и убедитесь, что выбран центр первой лунки. Сосредоточьтесь на ячейках, расположенных в лунке, и установите Z-положение ступени. Когда настройки точны, выключите свет, чтобы начать эксперимент с визуализацией.

Когда изображение будет готово, масштабируйте и экспортируйте файлы стека изображений в программном обеспечении Image Capture, сохраняя изображения в формате TIFF для анализа. Чтобы проанализировать изображения, перетащите файл «Кинетический анализ васкулогенеза» из папки на серую панель в нижней части окна программы, чтобы открыть программу, и нажмите «Сохранить», чтобы добавить программу в список. Нажмите «Файл и открыть», чтобы выбрать файл изображения для открытия, или перетащите файл изображения на серую полосу в программе.

Нажмите «Изображение», «Настройка» и «Яркость/контрастность», чтобы открыть окно «Яркость/контрастность». Нажмите кнопку «Сброс» в окне «Яркость/контрастность», чтобы визуализировать изображение. Затем нажмите «Изображение», «Тип» и «8-бит», чтобы преобразовать изображения в 8-битные.

Выберите «Инструменты» и «Менеджер областей интереса» и используйте инструмент выделения соответствующей формы для создания новой области интереса. Нажмите кнопку Добавить, чтобы добавить фигуру области интереса в окно Менеджер областей интереса, и нажмите на метку Область интереса в Менеджере областей интереса, чтобы просмотреть область на изображении. При необходимости настройте область интереса.

Когда область будет на месте, нажмите «Изображение», затем «Обрезать», чтобы обрезать изображение. Затем откройте меню «Правка» и выберите «Очистить снаружи», чтобы удалить данные изображения за пределами интересующей области для каждого изображения в стеке. Далее откройте меню «Плагины» и выберите плагин «Анализ сети».

Используйте стрелку раскрывающегося списка во всплывающем окне, чтобы изменить метод порогового значения, и нажмите OK, чтобы начать обработку программного обеспечения. В конце анализа откроется таблица данных и стек объединенных изображений, изображающих представления скелета и маски. Нажмите «Файл» и «Сохранить как», чтобы перенести числовые значения в электронную таблицу, и сохраните таблицу, содержащую необработанные значения данных.

Нажмите на изображение объединенного скелета и маски и сохраните объединенный стек изображений скелетной маски и обрезанный стек изображений фазового контраста в виде файлов TIFF. Затем нажмите на окно «Менеджер областей интереса», выберите область интереса, используемую для обрезки изображений, и нажмите «Еще» и «Сохранить», чтобы сохранить интересующую область для использования в будущем. Эндотелиальные колониеобразующие клеточные сети, идентифицированные с помощью кинетического анализа васкулогенеза, представлены в виде скелета и маски, чтобы проиллюстрировать структуры, используемые программным обеспечением для количественной оценки.

Когда качество фазово-контрастных изображений высокое и достаточный контраст достигнут, кинетический анализ васкулогенеза позволит точно идентифицировать эндотелиальные колониеобразующие клеточные сети, о чем свидетельствует сходство, наблюдаемое между фазовым контрастным изображением и представлениями, полученными с помощью скелета и маски, полученных методом кинетического анализа васкулогенеза. Если фазово-контрастные изображения не отличаются высокой контрастностью или если возникают артефакты изображения, такие как сетка, точность обнаружения сети снижается, а результаты становятся неоднозначными. Тем не менее, различные методы пороговых значений, такие как Mean и Otsu, показанные здесь, могут быть выбраны перед анализом в выпадающем меню программного обеспечения, чтобы учесть различия в качестве изображения.

Использование кинетического анализа васкулогенеза для определения того, демонстрируют ли эндотелиальные колониеобразующие клетки, подвергшиеся воздействию гестационного сахарного диабета, измененную кинетику формирования сети, выявляет гетерогенное изменение структуры сети в культурах гестационного сахарного диабета по сравнению с культурами эндотелиальных колониеобразующих клеток от неосложненной беременности. Действительно, образцы неосложненной беременности обычно образуют большее количество замкнутых сетей по сравнению с образцами гестационного сахарного диабета. Однако все образцы эндотелиальных колониеобразующих клеток в целом демонстрируют двухфазный паттерн формирования сетей, хотя скорость образования и максимальное количество достигаемых сетей варьируются в разных образцах.

Следуя этой процедуре, значения данных, полученные с помощью кинетического анализа васкулогенеза, могут быть построены на графике и проанализированы, чтобы определить, являются ли структуры сети, образованные различными образцами, статистически различными, и если да, то в какие моменты времени. Кинетический анализ васкулогенеза позволяет эффективно проводить покадровые эксперименты с большим количеством изображений. После освоения получение, постобработка и анализ изображений могут быть завершены за два дня, если все системы работают должным образом.