Мультиплексированных изотермической амплификация на основе диагностики платформы для обнаружения Зика, чикунгуньи и денге 1

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать использование мультиплексной диагностической платформы на месте оказания медицинской помощи, которая не требует обширной подготовки образцов и дорогостоящих инструментов и используется в различных биологических образцах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области диагностики на месте оказания медицинской помощи, такие как обнаружение различных целей в одной реакционной пробирке. Используя петлевую изотермическую амплификацию в сочетании с зондами, смещающими цепи, специфичными для мишени, можно эффективно обнаруживать три различных вируса.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует изотермическую амплификацию вместо ПЦР, требует минимальной подготовки образца и может быть применен к целому ряду клинических образцов. Начните с разрезания листов бумаги Q-paper на небольшие прямоугольники размером три на четыре миллиметра с помощью дырокола для бумаги. Затем с помощью микропестика измельчите самок комаров Aedes aegypti, потенциально зараженных вирусом Зика, на каждой бумаге.

Нанесите пипеткой 20 микролитров одного молярного водного раствора аммиака на каждый лист бумаги. Через пять минут промойте каждую бумагу 20 микролитрами 50% этанола, а затем 20 микролитрами воды, не содержащей нуклеаз. Высушите бумагу на воздухе в шкафу биобезопасности BSL-2 в течение примерно одного часа.

После сушки с помощью пинцета полностью погрузите каждую бумагу в 100 микролитров реакционной смеси RT-LAMP и инкубируйте при температуре от 65 до 68 градусов Цельсия в течение 45 минут. Считывание и запись флуоресценции, вызванной вирусом Зика, с помощью напечатанного на 3D-принтере наблюдательного бокса со светодиодным источником света и оранжевым или желтым фильтром. Начните с добавления 90 микролитров 1,1-кратного регидратационного буфера в каждую реакционную пробирку, содержащую лиофилизированные реагенты RT-LAMP, и растворите путем встряхивания.

Затем кратковременно уменьшите скорость вращения в 1 000 раз от силы тяжести. После центрифугирования добавьте 10 микролитров образца мочи, наполненного вирусной РНК, в реакционные пробирки и перемешайте с помощью пипетирования. Если вы тестируете комаров, добавьте прямоугольник ватной бумаги, в котором хранятся туши комаров, вместе с 10 микролитрами очищенной воды вместо мочи.

Поместите закрытые пробирки в нагревательный блок, предварительно установленный на 65–68 градусов Цельсия, и инкубируйте в течение 30–45 минут. После инкубации держите пробирки закрытыми, чтобы предотвратить загрязнение будущих анализов, и поместите в коробку для наблюдения. Включите переключатель на задней панели наблюдательного блока.

Наблюдайте за образцом через оранжевый фильтр и захватывайте изображение камерой мобильного телефона, которая находится на расстоянии, где изображение заполняет 80% поля зрения. После завершения визуализации выключите переключатель. Храните герметичные пробирки в темноте, желательно в холодильнике, если позже потребуется визуализация.

Как в одиночных, так и в мультиплексных случаях продукты RT-LAMP отображаются в виде буквы конкатемеров при использовании агарозного геля. Отрицательные контрольные образцы, содержащие воду в качестве образца, давали только полосы для самих праймеров, включая неспецифический контрольный мишень, где в качестве матрицы использовалась общая нуклеиновая кислота, выделенная из неинфицированной самки комара. Зеленая флуоресценция наблюдается для вируса Зика с использованием зондов в виде пяти простых NT, меченных FAM.

Светло-зеленая, желтая флуоресценция назначена Чикунгунье, где зонд представляет собой пять простых NT, меченных HEX. Оранжевая и красная флуоресценция используется для Dengue-1, где его зонд представляет собой пять простых NT, меченных TAMRA. Две бумаги, содержащие комаров, были непосредственно погружены в смесь RT-LAMP, и после инкубации при температуре 65 градусов Цельсия в течение 30 минут наблюдалась ярко-зеленая флуоресценция в присутствии вируса Зика.

Используя девять объемов регидратационного буфера и один объем образца мочи, видимая зеленая флуоресценция может быть сгенерирована в течение 30 минут, и изображение может быть захвачено любой камерой мобильного телефона. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клинической диагностики к изучению платформ для обнаружения вирусов, переносимых комарами, в моче, крови, слюне или тушах комаров. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать систему изотермической амплификации, в данном случае лампу, для мультиплексного обнаружения вируса Зика и других арбовирусов в различных биологических образцах.