Изучение Monosynaptic соединения у дрозофилы , используя устойчивые Тетродотоксин натриевые каналы

Общая цель этого метода заключается в электрофизиологической идентификации моносинаптических связей у дрозофил с использованием тетродотоксинорезистентных натриевых каналов. Основные преимущества этой методики в том, что она проста и может раскрыть химическую природу синапсов. Он также подходит для исследования объемной или объемной передачи.

Как правило, в видео, впервые знакомых с этим методом, мы испытываем трудности из-за сложности вскрытия. Однако, просто понимая метод, логика легко может быть перенесена на другие модельные системы, такие как мыши. Для записи используйте патч-пипетки для сопротивления около семи мегаом.

Кроме того, имеют наружный регистрирующий физиологический раствор с pH 7,3 или менее, непрерывно аэрируемый карбогеном, содержащим 95% кислорода и 5% углекислого газа. У испытуемых должна быть мушка, экспрессирующая csChrimson, размножающаяся на пище, содержащей 0,2 миллимоляра всех транс-ретиналей. Для записей выберите взрослых в возрасте от одного до трех дней.

Загрузите их в стеклянный сцинтилляционный флакон и обездвижьте его, используя одну минуту воздействия ледяных условий. Затем уменьшите уровень освещенности на препарирующем эндоскопе и с помощью грубых щипцов загрузите анестезированную муху в специально изготовленную записывающую камеру. Закрепите муху в камере, окружив воском или УФ-отверждаемой эпоксидной смолой.

Расположите его спинной стороной вверх так, чтобы фольга находилась примерно на полпути вверх по грудной клетке. Ключом к получению отличной подготовки является вырезание отверстия в фольге нужного размера, чтобы муха не сжималась и не могла провалиться. Освещайте препарат оптоволоконными лампами с обеих сторон и следите за тем, чтобы они были как можно более тусклыми.

Далее покройте препарат четырьмя-шестью каплями записывающего физиологического раствора. Далее заточите вольфрамовую проволоку или нить для вскрытия. Подайте около 20 вольт переменного тока в насыщенный нитратом калия раствор и многократно очень быстро опустите кончик провода в раствор.

После 20 погружений кончик будет острым. Теперь отрегулируйте освещение так, чтобы обеспечить достаточную видимость, чтобы использовать заостренную проволоку, чтобы обнажить мозг, удалив кутикулу, а затем трахею и жировые тела. Чтобы получить доступ к лепесткам антенны, используйте изогнутую вольфрамовую проволоку, чтобы аккуратно заправить антенну под защитный экран из фольги.

Затем с помощью острых щипцов аккуратно оторвите глиальную оболочку, покрывающую интересующую область. Теперь перенесите препарат в электрофизиологическую установку для проведения записей. На оснастке немедленно приступайте к перфузию препарата с записывающим физиологическим раствором, пузырчатым карбогеном.

Используйте резервуар с гравитационной подачей солевого раствора, расположенный над предметным столиком микроскопа. Для сбора отработанного солевого раствора используют вакуумную линию и колбу объемом 2 литра. Далее загрузите в патч-пипетку 4 микролитра раствора для внутренней записи и подсоедините пипетку к микроманипулятору.

Затем обнулите смещение усилителя и настройте усилитель на подачу тестовых импульсов. Затем отрегулируйте ИК-подсветку под углом, чтобы получить четкое изображение мозга. Теперь, оказывая положительное давление на пипетку, подойдите к ячейке с пипеткой.

При контакте с клеткой сбросьте положительное давление, чтобы прижать пипетку к мембране. Затем установите удерживающий потенциал мембраны на уровне минус 60 милливольт. А пипетка должна образовывать гигаомное уплотнение с клеточной мембраной.

Удерживаемый ток должен упасть до такого же низкого уровня субпикоампера. Чтобы получить постоянное гигаомное уплотнение, следите за чистотой пипетки, поддерживая положительное давление, и избегайте попадания в ткани или приближения к клеткам. Чтобы продолжить, настройте усилитель на выдачу тестовых импульсов от минус 50 до минус 60 милливольт.

Тестовые импульсы выявят большой емкостный переходный процесс, представляющий собой ток, необходимый для зарядки патч-пипетки. Чтобы удалить емкостную переходную способность, отрегулируйте ручки компенсации емкости на усилителе. Теперь примените короткие импульсы отрицательного давления, чтобы разорвать клеточную мембрану и получить всю конфигурацию клетки.

Значительное увеличение емкостной переходной способности свидетельствует об успехе. Также следует наблюдать небольшое увеличение удерживаемого тока. Затем установите усилитель в режим токовых зажимов.

И отрегулируйте потенциал ячейки в диапазоне от минус 50 до минус 60 милливольт. При подготовке настройте систему сбора данных так, как указано в протоколе технического специалиста. Для системы требуется мощный красный светодиод, расположенный под препаратом, расположенный так, чтобы освещать муху с мощностью 0,238 милливатт на квадратный миллиметр.

Теперь активируйте пресинаптические нейроны оптогенетически, используя импульсный красный свет в экспрессии csChrimson. Можно использовать и другие методы. Перед применением тетродотоксина должно быть видно синаптическое соединение в ответ на 40-миллисекундный световой импульс.

Отсутствие ответа означает, что соединение маловероятно. Удерживающий потенциал может быть отрегулирован таким образом, чтобы подчеркнуть возбуждающие или тормозящие связи, соответственно. После того, как соединение будет проверено, настройте изобилие солевого раствора для рециркуляции в физрастворе.

Установите насос так, чтобы уровень физиологического раствора в ванне оставался стабильным. Затем добавьте в систему достаточное количество тетродотоксина для конечной концентрации одного микромоляра. Это должно остановить пиковую активность поврежденного нейрона.

Если нет, добавьте в систему больше тетродотоксина. Теперь примените короткие импульсы красного света, чтобы активировать то, что, скорее всего, будет моносинаптической связью. Затем добавьте фармакологические антагонисты к рециркулирующему физиологическому раствору, чтобы проверить химическую природу синаптических соединений.

Трансгенная экспрессия тетродотоксина в чувствительном натриевом канале восстанавливает возбудимость нейронов и приводит к большому потенциалу плато. Интернейроны в доле антенны реагируют на запахи. Тем не менее, возбуждающие постсинаптические токи не так легко разрешаются в соме.

Итак, возникают ли реакции непосредственно из-за входа нейронов обонятельных рецепторов? Использование tERP показывает, что нейроны обонятельных рецепторов устанавливают прямые связи с локальными интернейронами. Стимуляция серотонинергических нейронов в антенной доле приводит к смеси возбуждения и торможения в локальных интернейронах.

Применение метисергида, антагониста широкого спектра 5HT-рецепторов, блокировало медленную гиперполяризацию, но не влияло на деполяризацию, в то время как мекамиламин блокировал быструю деполяризацию. Это говорит о том, что стимуляция является холинергической. tERP использовался для разрешения внесинаптической объемной передачи, которая происходит с помощью ГАМК или нейромодуляторов.

В одном из примеров применение тетродотоксина не подавляло тормозящий сигнал в локальном интернейроне. Это ингибирование блокировалось с помощью антагониста серотонина, метисергида, что предполагает прямой сигнал от конкретного серотонинергического нейрона. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить целые клеточные записи нейронов дрозофилы и оценить их проводимость с помощью tERP.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о терпении и многократно практиковать сложное рассечение. После освоения этой техники ее можно сделать примерно за час, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как фармакология, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как природа химического синапса.

Не забывайте, что работа с тетродотоксином может быть чрезвычайно опасной и при выполнении этих процедур всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и работа с небольшими объемами.