Исследования синтеза РНК с помощью 5-Bromouridine маркировки и иммунопреципитации

Общая цель этого эксперимента — измерить изменения в синтезе РНК путем мечения бромуридином и иммунопреципитации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метаболизма РНК, измеряя, вызвано ли изменение уровня РНК изменениями в синтезе РНК. Основное преимущество этой методики заключается в том, что ее можно использовать на любом предпочтительном типе клеточной культуры, а используемые материалы легко доступны.

Чтобы начать протокол, засейте в 3,5 раза по 10 до шестой HEK293T клетки в 10-сантиметровую чашку Петри в 10 миллилитрах питательной среды, чтобы получить в общей сложности более 40 микрограммов РНК при экстракции через 48 часов. Поддерживайте температуру в клетках при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2,48 часа после посева, аспирируйте восемь миллилитров питательной среды и оставьте два миллилитра, чтобы предотвратить высыхание клеток. Добавьте два миллимоля бромуридина и обработайте питательную среду и удалите оставшиеся два миллилитра из клеток перед повторным нанесением восьми миллилитров бромуридина, содержащей питательную среду.

Далее инкубируйте клетки в течение одного часа. После инкубации промойте клетки в пяти миллилитрах буфера Хэнка, и трипсинизируйте клетки двумя миллилитрами 0,05% трипсина в течение пяти минут. Добавьте восемь миллилитров питательной среды, чтобы остановить реакцию, перенесите клетки в 15-миллилитровую пробирку и вращайте клетки в течение двух минут при 1000 раз больше g.

Затем удалите надосадочную жидкость и извлеките общую РНК из клеточной гранулы с помощью набора для выделения РНК и элюируйте РНК в воде, не содержащей РНКазы. Эта методика очень чувствительна, поэтому важно работать с РНК высокого качества. Таким образом, экстракция РНК является критически важным этапом, но она также легко выполняется с помощью современных наборов для экстракции РНК.

Приготовьте бусины в одной партии на количество образцов, которые необходимо исследовать, плюс один дополнительный для учета потерь во время пипетирования и вихревого смешивания. Тщательно ресуспендируйте магнитные шарики IgG, претендовавшие против мыши, путем вихревого перемешивания и выньте 20 микролитров шариков на образец в пробирке объемом 1,5 миллилитра без РНКазы. Поместите 1,5-миллилитровую трубку в магнитную подставку на 20 секунд, чтобы бусины собрались сбоку.

Извлеките надосадочную жидкость, выньте трубку из магнитной стойки и повторно суспендируйте шарики в 40 микролитрах одноразового буфера бромуридина-IP путем пипетирования. Вращайте пробирку в течение двух секунд в настольной центрифуге, поместите ее обратно в магнитную подставку и удалите надосадочную жидкость. Далее заблокируйте неспецифическое крепление к бусинам с помощью гепарина.

Повторно суспендируйте шарики в одном миллилитре однократного бромуридина-IP плюс один миллиграмм на миллилитр гепаринового буфера, и вращайте трубку в течение 30 минут. Затем промойте бусины один раз. Ресуспендируйте гранулы в одном миллилитре буфера однократного бромуридина-IP и добавьте 1,25 мкг на образец антитела против альфа-бромодоксиуридина.

Инкубируйте бусины в течение одного часа при вращении. После инкубации промойте бусины три раза. Повторно суспендируйте промытые шарики по 50 микролитров на образец одноразового буфера бромуридина-ИП с добавлением одного миллимоляра бромуридина и оставьте шарики вращаться в течение 30 минут.

После вращения промойте бусины три раза, и снова суспендируйте бусины по 50 микролитров на пробу одноразового буфера бромуридин-IP. Измерьте концентрацию РНК в экстрактах РНК с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии и разведите 40 микрограммов РНК из каждого образца в воде, не содержащей РНКазы, до общего объема 200 микролитров. После денатурации РНК в течение двух минут при температуре 80 градусов Цельсия кратковременно поверните образцы в настольной центрифуге.

После отжима добавьте 200 микролитров двукратного бромуридина-IP плюс БСА, ингибитор РНКазы. Затем добавьте 50 микролитров ресуспендированных и подготовленных бусин в каждый образец, и вращайте образцы в течение одного часа. После инкубации вымойте бусины четыре раза.

Суспендируйте гранулы в 200 микролитрах элюирующего буфера, чтобы элюировать РНК, и быстро добавьте 200 микролитров фенола pH 6,6, чтобы удалить любые молекулы, не относящиеся к РНК, из образца. Взбейте образец для смешивания и вращайте его в течение трех минут при 25 000 раз g в настольной центрифуге. Затем отсадите как можно больше верхней фазы, примерно 190 микролитров, и переместите ее в пробирку с 200 микролитрами фенол-хлороформа pH 6,6.

Убедитесь, что вы отсасываете одинаковое количество во всех образцах. Вращайте образец и вращайте его. После отжима проводят экстракцию хлороформа, отсасывая водную верхнюю фазу, примерно 180 микролитров, и переносят ее в пробирку, содержащую 200 микролитров хлороформа.

Вращайте, а затем вращайте образец. Отсадите водную верхнюю фазу, примерно 170 микролитров, и перенесите ее в пробирку, содержащую 17 микролитров трех моляров pH шести ацетата натрия для нейтрализации и осаждения РНК из водного раствора. Далее добавьте два микролитра гликогена, который выпадет в осадок вместе с РНК и сделает гранулу более заметной.

Добавьте 500 микролитров 96% этанола, чтобы усилить связывание между ионами соли и РНК, и перемешайте, перевернув пробирку пару раз. Оставьте тюбик на ночь при температуре минус 20 градусов Цельсия или на 15 минут на сухом льду. Открутите охлажденный образец, выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы, и промойте гранулу в 185 микролитрах 75% этанола, чтобы удалить остатки соли.

Затем вращайте образец при температуре 25 000 раз больше g при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Полностью выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы, и дайте гранулам высохнуть на пять-10 минут с открытой крышкой. Повторно суспендируйте гранулу в 10 микролитрах воды, не содержащей РНКазы, нанесенной на боковую сторону трубки, чтобы не потревожить гранулу.

Клетки AsPC-1 обрабатывали бромуридином в течение нуля, одного, двух и 4,5 часов с последующей экстракцией общей РНК и бромуридином-IP. GAS5 и GAPDH были измерены в РНК бромуридина-IP, что продемонстрировало, что одного часа мечения было достаточно для достижения девяти- и 44-кратного изменения по сравнению с фоном. Два миллимоля бромуридина не вызывали каких-либо морфологических изменений в HEK293T клетках ни в течение одного часа, ни в течение более длительного четырехчасового лечения.

Ингибирование PLK-2 вызывало увеличение мРНК альфа-синуклеина как на входе, так и на бромуридине-IP, что позволяет предположить, что увеличение равновесной РНК вызвано увеличением синтеза РНК. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как мечить только что синтезированную РНК бромуридином и выполнять последующую иммунопреципитацию бромуридина и меченой РНК.