Легковесные протокол для создания Site-Specifically ацетилированный белков в Escherichia Coli

В этой работе мы продемонстрируем простой протокол для получения гомогенных ацетилированных белков в определенных местах с использованием E.coli в качестве хозяина экспрессии. Обратимое ацетилирование лизина белков является одной из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций в природе. Он играет важную роль в широком спектре биологических процессов, включая транскрипцию генов, реакцию на стресс, клеточную дифференцировку и метаболизм.

Генерация чисто ацетилированных белков в проектных положениях очень полезна для изучения ацетилирования белков. Однако для большинства классических методов это сложно. Эта проблема была решена с помощью метода расширения генетического кода.

Он использует сконструированный вариант пирролизил-тРНК-синтетазы для зарядки тРНК-Пил ацетиллизином, затем использует механизм трансляции хозяина для подавления стоп-кодона UAG в мРНК и направляет включение ацетиллизина в проектное положение белка-мишени. Во-первых, янтарный стоп-кодон должен быть введен в соответствующее положение в гене-мишени путем сайт-направленного мутагенеза. Амплифицируйте матричную плазмиду, содержащую ген белков дикого типа, и вставьте мутацию стоп-кодона из праймеров с помощью реакции ПЦР.

После ПЦР амплифицированный материал добавляют непосредственно в смесь ферментов киназа-лигаза-Dpn1 в течение одного часа при комнатной температуре для циркуляризации и удаления матрицы. Добавьте пять микролитров смеси в пробирку с 25 микролитрами размороженных компетентных клеток кишечной палочки. Осторожно перемешайте тюбик и положите смесь на лед на 30 минут.

Измельчите смесь при температуре 42 градуса Цельсия в течение 30 секунд и положите на лед еще на пять минут. Пипеткой внесите в смесь 600 микролитров среды SOC комнатной температуры. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут с встряхиванием.

Нанесите на тарелку 100 микролитров с соответствующим антибиотиком и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Плазмида из одной колонии отправляется на секвенирование. Вторым шагом является экспрессия и очистка сайт-специфического ацетилированного белка.

Возьмите одну колонию из планшета, которая содержит мутировавший ген-мишень, содержащий TAG, и систему включения ацетиллизина. Заквашивайте в 15 миллилитров свежей среды LB соответствующими антибиотиками в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Перенесите 15-миллилитровую культуру на ночь в 300 миллилитровую свежую среду с антибиотиками и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия.

Добавляйте пятимиллимолярный ацетиллизин и 20-миллимолярный никотинамид в качестве конечных концентраций в питательных средах, когда поглощение достигает 5 при 600 нанометрах. Выращивайте клетки еще один час при температуре 37 градусов по Цельсию. Затем добавьте индуктор для экспрессии белка и выращивайте клетки при температуре 25 градусов Цельсия в течение ночи.

Соберите клетки центрифугированием при 3 000 г в течение 15 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и храните клеточные гранулы при температуре минус 80 градусов. Разморозьте замороженные клеточные гранулы на льду и ресуспендируйте 15 миллилитров буфера для лизиса, пять микролитров бета-меркаптоэтанола и один микролитр нуклеазы.

Клетки разрушаются с помощью ультразвука. Центрифугируйте сырой экстракт при температуре 20 000 г в течение 25 минут при четырех градусах. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью мембранного фильтра на 45 микрометров.

Загрузите отфильтрованный образец в колонку, содержащую один миллилитр никелевой смолы NTA, уравновешенную 20 миллилитрами буфера для лизиса. Промойте колонку 20 миллилитрами буфера для промывки. Целевой белок ускользает с помощью двух миллилитров элюирующего буфера.

Очищенный белок обессоливают в колонке PD-10 с добавлением образца объемом 2,5 мл, а обессоленный образец собирают с помощью буфера для обессоливания объемом 3,5 мл. Следующим шагом является биохимическая характеристика очищенного ацетилированного белка. Денатурируйте белки с помощью буфера для образца SDS при температуре выше 100 градусов в течение пяти минут.

Центрифугируйте смесь, загрузите в гель SDS-PAGE и работайте при напряжении 200 вольт в течение 30 минут. Смойте гель дистиллированной водой и аккуратно встряхните. Чтобы сделать бутерброд для вестерн-блоттинга, от катода до анода идет губка, фильтровальная бумага, буфер для переноса, пропитанный гель SDS-PAGE, мембрана, активированная метанолом PVDF, еще одна фильтровальная бумага, удалите пузыри в бутерброде и еще одна губка.

Поставьте стопку в передаточный бак. Работайте при постоянном токе 350 миллиампер в течение 45 минут. Промойте мембрану PVDF 25 миллилитровым буфером TBST в течение пяти минут с легким встряхиванием.

Заблокируйте мембрану 5% BSA и буфером TBST на один час при комнатной температуре. Инкубируйте мембрану с разведенным HRP-конъюгированным ацетиллизиновым антителом при комнатной температуре в течение одного часа или четырех градусов в течение ночи с легким встряхиванием. Промойте мембрану 20 миллилитровым буфером TBST в течение пяти минут, слегка встряхивая.

Повторите этот шаг четыре раза. Нанесите хемилюминесцентный субстрат на мембрану на одну минуту. Захватите сигнал с помощью базового тепловизора ПЗС-камеры.

Те же объемы фракций элюирования и очистки белка загружались на гель SDS-PAGE. Выход ацетилированного белка составляет примерно половину от выхода белка дикого типа, который обладает высокой эффективностью, и тот же экспрессирующий штамм без ацетиллизина и питательных сред не может производить белки с обнаруживаемым количеством, что указывает на высокую чистоту ацетилированного белка, поскольку в этом специфическом положении отсутствуют канонические аминокислоты. Вестерн-блоттинг показал, что в белке дикого типа отсутствует обнаруживаемое ацетилирование, что указывает на низкий фон неспецифического ацетилирования этой системы экспрессии, в то время как ацетилированный белок имел четкую полосу.

Тандемная масс-спектрометрия подтвердила, что ацетилирование происходит в правильном участке, соответствующее положение которого в гене мутировало в стоп-кодон. Для получения хорошего выхода и чистоты ацетилированных белков следует использовать оптимизированную систему включения ацетиллизина, обеспечивающую как высокую эффективность, так и высокую чистоту. Для повышения чистоты следует использовать клетки BL21(DE3) для низкофонового и неспецифического ацетилирования.

Система генетического включения может быть использована в эукариотических системах для более широкого применения.