Оценка функции внеклеточного пузырьков во время инфекции малярии

В этой работе мы описываем протоколы для расследования роли внеклеточных везикулы (EVs) выпущен в эритроцитах Plasmodium falciparum инфицированных. В частности мы сосредоточены на взаимодействии EVs с эндотелиальных клеток.

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании функции внеклеточных везикул, выделяемых эритроцитами, инфицированными малярийным паразитом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области малярии, например, как паразиты регулируют коммуникацию паразита с хозяином. Основным преимуществом данной методики является визуализация везикулярного арбитажа индотеротными клетками при изучении регуляторной функции везикулярной РНК индотеротными клетками.

Демонстрировать процедуру будут Миа Алондес, Смартин Багу и Байо Бабатунде, все аспиранты из моей лаборатории. В микроцентрифужную пробирку добавьте 100 мкг внеклеточных везикул и один миллилитр фосфатно-солевого буфера. Затем центрифугируйте внеклеточные везикулы с максимальной скоростью 20 000 раз g в течение семи минут до образования гранулы.

После завершения центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, не повреждая гранулы. Затем растворите внеклеточную пузырьковую гранулу в 100 микролитрах дилумата C.To обеспечьте полное перемешивание пипеткой в несколько раз. Затем в новую микроцентрифужную пробирку добавьте четыре микролитра раствора этанолового красителя PKH67 на 100 микролитров дилманта С. Затем хорошо

Приготовьте 40 микромолярный раствор красителя 2XPKH67 непосредственно перед процессом окрашивания. Затем быстро соединить 100 микролитров двух х внеклеточных везикулярных суспензий с равным объемом раствора этанолового красителя PKH67. Затем измельчите смесь пипеткой 10 раз, чтобы обеспечить правильное перемешивание.

После полного перемешивания инкубируйте внеклеточный везикулярный раствор и раствор этанолового красителя PKH67 в течение пяти минут вдали от света. В ходе инкубации продолжайте перемешивать смесь три-четыре раза. Чтобы остановить реакцию окрашивания, добавьте в смесь 200 микролитров сыворотки и выдержите минуту, чтобы лишний краситель связался.

Затем трижды промойте внеклеточные пузырьки фосфатно-солевым буфером. После промывки центрифугируйте образец при 20 000 раз g в течение пяти минут. Затем растворите внеклеточную везикулярную гранулу в 100 микролитрах фосфатно-солевого буфера до достижения конечной концентрации в один микрограмм на микролитр.

Перенесите эндотелиальные клетки в одном миллилитре полной среды для роста эндотелиальных клеток в покровное стекло, покрытое полиэлитеновым покрытием. Дайте ячейкам вырасти монослоем на покровном листе. После того, как монослой сформируется, аккуратно удалите среду и добавьте один миллилитр свежей среды, чтобы промыть клетки дважды.

Затем добавьте 50 мкг окрашенных PKH67 внеклеточных везикул в покровную крышку и инкубируйте в течение четырех часов. После инкубации аспирируйте среду. Чтобы удалить все несвязанные внеклеточные пузырьки, трижды промойте клетки фосфатно-солевым буфером.

Следует проявлять большую осторожность при окрашивании покровных пластин с помощью тонких щипцов, чтобы избежать потери клеток и поломки покровного стекла. После промывания используйте трехпроцентный раствор параформальдегида в фосфатно-солевом буфере, чтобы зафиксировать клетки на 15 минут. Снова трижды промойте клетки фосфатно-соевым буфером и добавьте 250 микролитров 0,1-процентного тритана x 100 в фосфатно-солевой буфер, чтобы пропитать клетки, и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем трижды промойте клетки фосфатно-солевым буфером и добавьте в клетки 400 микролитров блокирующего буфера. Затем инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение тридцати минут, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. После блокировки промойте клетки один раз фосфатно-соевым буфером.

Затем разведите пять микролитров стокового раствора фаллоидена в 200 микролитрах фосфатно-солевого буфера с однопроцентным бычьим сывороточным альбумином, чтобы приготовить окрашивающий раствор для каждого покровного листка. Затем добавьте 200 микролитров раствора для окрашивания на покровную крышку и выдерживайте при комнатной температуре в течение 20 минут. Как только инкубация закончится, трижды промойте клетки фосфатно-солевым буфером.

Затем используйте концентрацию 2 микрограмма на миллилитр 3342 в 200 микролитрах фосфатного буферного раствора для противодействия окрашиванию ДНК в течение 30 секунд. После окрашивания добавьте 400 микролитров фосфатно-солевого буфера, чтобы дважды промыть покровную пленку. Затем осторожно поднимите крышку с помощью щипцов и переверните ее сверху каплей антивыцветающего крепежного носителя на предметном стекле

С помощью салфетки аккуратно удалите излишки среды, а затем запечатайте окружающее лаком. Также следует проявлять большую осторожность, чтобы не подвергать клетки воздействию слишком большого количества красителя во время микроскопии, чтобы избежать обесцвечивания клеток. В 24 лунки вставка для культуры тканей с размером 0,4 микромоля затравливает эндотелиальные клетки.

Затем дайте клеткам расти в культуре в течение пяти дней, не нарушая их, чтобы образовался дифференцированный монослой. Продолжайте менять носитель каждый второй день. Как только монослой сформируется, засейте 50 мкг в один миллилитр внеклеточных пузырьков на верхнюю камеру.

Затем добавьте 20 миллиграммов на миллилитр ротомина декстрана в верхнюю лунку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с пятью процентами углекислого газа. Отслеживайте миграцию флуоресцентного декстрана на дно лунки, измеряя миссию флуоресценции от 40 микролитров среднего авоквата. Затем запрограммируйте длину волны возбуждения на 544 нанометра и длину волны излучения на 590 нанометров для считывателя микропланшетов с несколькими метками.

Используйте гемоцитометр для подсчета количества клеток. Затем повторно суспендируйте эндотелиальные клетки в полной среде для культивирования эндотелия и засейте клетки в 96-луночный планшет в 100 микролитров среды для роста эндотелиальных клеток. Для достижения концентрации от 0,1 до десяти микрограмм на миллилитр добавляют 100 микролитров среды, содержащей антибиотик.

Контролируйте жизнеспособность клеток каждые два дня с помощью объектива с 20-кратным увеличением под световым микроскопом. Продолжайте культивирование клеток в течение еще 10-14 дней и заменяйте среду, содержащую антибиотик, каждые два-три дня, в зависимости от роста клеток. Далее в каждую лунку добавляем по 10 микролитров реактива МТС и перемешиваем реагент.

Инкубируйте 96-луночный планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов. Через четыре часа слегка взболтайте тарелку на шейкере. Затем считайте абсорбенты обработанных и необработанных клеток с помощью планшетного ридера с яркостью 490 нанометров.

За сутки до лентивирусной трансдукции засейте эндотелиальные клетки в одном миллилитре готовой среды. Подождите, пока клетки достигнут 50-80-процентной конфлюенции для лентивирусной трансдукции Прежде чем открыть пробирку, вращайте чечевичную суспензию в 200 раз g в течение 30 секунд, чтобы избежать распространения. Затем добавьте в клетки гексидиметрин бромид, чтобы довести до конечной концентрации восемь микрограммов на миллилитр и аккуратно взболтайте пластину.

Добавьте лентивирус к клеткам и снова осторожно поворачивайте пластину в течение 30 секунд, чтобы обеспечить правильное перемешивание. Чтобы повысить эффективность лентивирусной трансдукции, центрифугируйте клеточно-вирусную смесь при 300-кратном g в течение 45 минут при комнатной температуре. Затем инкубируйте клеточно-вирусную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

На следующий день выбросьте среду, содержащую вирусные частицы, и замените ее предварительно подогретой, свежей, готовой питательной средой. На второй день приступают к подбору пуромицина. Замените полностью питательную среду средой, содержащей пуромицин.

После отбора пуромицина соберите клетки. Следуя инструкциям производителя, изолируйте РНК из клеток с помощью набора для выделения РНК. Используйте набор для обратной транскрипции, чтобы выделить комплементарную ДНК с выбранными микро-РНК.

Затем настройте количественную реакцию ПЦР. Для мониторинга интернализации внеклеточных везикул эндотелиальными клетками с помощью конфокальной микроскопии были проанализированы меченые зелеными везикулами PKH67. В анализе фалудин и хукст 33342, красители которых действуют красным и нуклеидным синим цветом, соответственно, используются для отслеживания транслокации везикул внутри эндотелиальных клеток.

Полученные конфокальные изображения показывают готовность к поглощению везикул эндотелиальными клетками через четыре часа. Далее, для изучения проницаемости эндотелиальных клеток была проанализирована диффузионная способность родамина b изотиозионадедекстрана. Этот анализ показывает, что инкубация эндотелиальных клеток с 50 и 100 мкг на миллилитр внеклеточных везикул увеличивает проницаемость эндотелиального монослоя через два часа.

На графике ось x представляет концентрацию внеклеточных везикул, а ось y представляет собой кратные изменения эндотелиальной проницаемости, измеренной на 590 нанометрах. Затем для определения чувствительности эндотелиальных клеток при лечении пуромицином была построена кривая уничтожения. Кривая уничтожения показывает, что менее 0,15 микрограмма на миллилитр пуромицина достаточно, чтобы убить все клетки.

Кроме того, для определения уровня экспрессии микро-РНК451а, выделенной из эндотелиальных клеток, была проведена количественная ПЦР в реальном времени. Столбчатые диаграммы показывают значительную сверхэкспрессию транскрипта микро-РНК451a против гена U6 домохозяйки. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области инфекционных заболеваний к изучению роли Evs во взаимодействии хозяина и клеточной коммуникации через передачу генетического материала. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как визуализировать поглощение EV клетками-реципиентами и как исследовать функцию малых РНК, в том числе и РНК, в регуляции эндотелиальных клеток.

Не забывайте, что работа с малярийными паразитами и человеческой кровью может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток, лабораторного халата и работа под стерильным капюшоном.