Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области кристаллизации белков, такие как временная точка зарождения, механизм роста кристаллов или способы получения нано/микрокристаллов, как это исследуется Гамбургским центром сверхбыстрой визуализации. Основным преимуществом этого метода является мониторинг эволюции образца в режиме реального времени, что позволяет получать ценную информацию, такую как радиальное распределение частиц в растворе на разных стадиях кристаллизации. Хотя этот метод может дать представление о микрокристаллизации белков, он также может быть использован для белков, которые используются для классической кристаллографии, или для выращивания больших кристаллов белка, которые используются для дифракции нейтронов.

Визуальная демонстрация этого метода важна, так как показывает принцип работы уникального кристаллизационного устройства. Для начала отфильтруйте 16 миллилитров 1,2 молярного раствора тартрата натрия и 16 миллилитров дистиллированной воды, используя стерильный шприцевой фильтр 2 микрона. Наполните бутылки с осадителем и водой пятью миллилитрами отфильтрованных растворов.

Затем смонтируйте бутылки в держатели насоса экспериментальной камеры. В окне программы задайте экспериментальные параметры с температурой 20 градусов Цельсия, относительной влажностью 20 градусов и водой в качестве растворителя. Откройте переднюю дверцу экспериментальной камеры и снимите держатель покровного стекла.

Наденьте чистую силиконизированную защитную крышку на держатель и поместите ее обратно в устройство. Закройте экспериментальную камеру, чтобы обезопасить условия окружающей среды. Включите Pump Zero, используя основные характеристики насоса, найденные в текстовом протоколе, и создайте водный поток.

Отрегулируйте поток воды, направив его положение к центру покровного стекла, вручную приводя в действие его специальный регулировочный винт. Выключите нулевой насос, затем включите первый насос и создайте поток жидкости, как и раньше. Отрегулируйте положение потока Pump One в направлении, зафиксированном для Pump Zero.

После выключения насоса номер один замените использованную защитную крышку на новую, чистую защитную крышку для эксперимента по кристаллизации. Создайте новый экспериментальный файл с помощью программного комплекса. В экспериментальный файл введите белок как тауматин из Thaumatococcus daniellii; Концентрация белка равна 14 миллиграммам на миллилитр, осадителю – тартрату натрия, а концентрация осадителя – 1,2 моляра.

После загрузки нового файла эксперимента для активации этой информации отметьте положение на капле белка, добавив небольшую каплю воды с помощью нулевого насоса. Нажмите кнопку Tara', чтобы обнулить микровесы. Откройте верхнюю крышку экспериментальной камеры и пипируйте 8 микролитров раствора Тауматина на воду ориентира.

Чтобы зарегистрировать новую каплю Тауматина, сначала нажмите на атрибут New Drop'to с начальными условиями из экспериментального файла. Затем нажмите кнопку Константа, чтобы компенсировать естественное испарение воды из капли. Используйте ПЗС-камеру, чтобы проверить, целится ли Pump Zero в каплю белка.

Отрегулируйте положение нулевого насоса, если струя воды направлена за пределы обрыва. Включите лазер DLS и поместите лазерный луч в каплю белка вручную с помощью регулировочных винтов. Введите параметры DLS с длительностью измерения 60 секунд, временем ожидания между двумя измерениями 10 секунд и количеством измерений равным 300.

Нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать измерения DLS. Проверьте качество образца, выбрав одно из графических представлений DLS. Введите условия для этапа выпаривания в таблицу расписания, как показано в текстовом протоколе.

Затем активируйте этап выпаривания образца, нажав кнопку «Автоматизация». Нажмите кнопку «Стоп», когда этап выпаривания образца будет завершен. Активируйте постоянную кнопку, чтобы вес капли оставался постоянным.

Эта функция компенсирует возможность естественного испарения образца и гарантирует, что никакие изменения концентрации не могут произойти до тех пор, пока не будут предприняты дальнейшие действия. Затем введите условия для шага добавления осадка в таблицу расписания, как указано в текстовом протоколе. Активируйте шаг добавления осадка, нажав кнопку «Автоматизация».

Чтобы отследить эволюцию кристаллизационной капли с течением времени, проверьте внешний вид кристаллов тауматина с помощью ПЗС-камеры. Проверьте распределение частиц по размерам с помощью графических представлений DLS. Также проверьте эволюцию весовых и экспериментальных параметров с помощью окна дисплея.

Вся информация, отображаемая в этом окне, рассчитывается и отображается в режиме реального времени на основе изменений веса во время кристаллизации, которые регистрируются в режиме реального времени сверхчувствительными весами. Смажьте чистую стандартную тарелку Терасаки, добавив в тарелку 3 миллилитра парафина. Рассыпьте парафин по пластинчатым лункам, осторожно перемещая пластину под разными углами так, чтобы нефть покрыла все 72 скважины.

Удалите излишки парафина, вылив масло, которое плавает на тарелке. Нажмите кнопку «Стоп», чтобы завершить эксперимент по кристаллизации. Осторожно извлеките носитель образца, содержащий кристаллизационную каплю.

С помощью пипетки поместите два микролитра кристаллизационной капли в лунки пластины Терасаки. Восстанавливая каплю кристаллизации в пластине под действием масла, образец можно периодически проверять на стабильность роста кристаллов с помощью микроскопа или других диолистических методов, работающих с пластинами Терасаки. На рисунке представлен радиусный график, показывающий рост размера частиц в капле белка в течение всего процесса кристаллизации от мономерного белка к образованию ядер, нанокристаллов и микрокристаллов.

Здесь графики представляют эволюцию с течением времени веса капли белка вместе с рассчитанной концентрацией белка и концентрацией осадка. Здесь показана записанная фотография микрокристаллов тауматина в конце эксперимента. Капля показывает очень обильное количество мелких микрокристаллов, насыщенных белковым раствором.

После освоения этой техники ее можно выполнить за один час и 30 минут, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно, чтобы вы настроили лазер DLS в системах микродозирования на белковую каплю. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как легко обращаться с этим устройством кристаллизации, чтобы успешно кристаллизовать образец белка.

Этот метод возможен благодаря динамическому рассеянию света in situ, которое напрямую связано с кристаллизационной каплей. Это позволяет нам отслеживать все изменения в распределении радиуса и, следовательно, мы можем точно определить определенные закономерности распределения, вплоть до кристаллизации или осаждения белка. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как криоэлектронная микроскопия или электронная дифракция, чтобы ответить на дополнительные вопросы и проверить кристаллическое состояние частиц субмикрометрового размера в растворе.

Последствия этого метода распространяются на двухступенчатую теорию зародышеобразования, поскольку карты DLS показывают четкую картину двойного распределения частиц в растворе, которые предшествуют росту кристаллов.