Протокол для лабораторных жилья из бирюзы Пецилиевые рыбы (Nothobranchius furzeri)

Общая цель этого протокола заключается в успешном выращивании лабораторной колонии бирюзовых рыб-убийц для быстрого и высокопроизводительного изучения старения и возрастных заболеваний. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области старения, например, могут ли мутации одного гена или вмешательство окружающей среды модулировать процесс старения у позвоночных видов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что, следуя нашим базовым протоколам, несколько лабораторий теперь могут проводить эксперименты с бирюзовыми рыбами-убийцами.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, поскольку разведение рыб-убийц имеет некоторые уникальные особенности. Например, эмбрионы выращиваются на сухом субстрате до вылупления, что сильно отличается от канонических моделей рыб, таких как данио-рерио. Для начала установите 9,5-литровые резервуары для разведения, в каждом из которых будет пятинедельный самец и две шести-семинедельные самки.

Затем заполните пластиковый контейнер автоклавным песком на глубину примерно два-три сантиметра и поместите песочницу в центр резервуара для разведения. Позвольте бирюзовым рыбам-убийцам размножаться непрерывно и собирайте эмбрионы раз в неделю для инкубации эмбрионов. Чтобы собрать эмбрионы на одной клеточной стадии для использования для инъекций и генерации трансгенных линий, установите аквариум для разведения с одним самцом и двумя самками рыб, как показано выше.

За два дня до сбора эмбрионов пересадите самца в отдельный аквариум и поддерживайте его в визуальном контакте со взрослыми самками. В день сбора добавьте самца и песочницу в аквариум для разведения и дайте рыбе отнереститься в течение двух часов. После нереста и извлечения песочницы из резервуара высыпьте песочницу в сетчатое фильтр и используйте системную воду для ее промывки.

Затем частично погрузите ситечко в воду системы и аккуратно покрутите его так, чтобы эмбрионы сгруппировались в центре. С помощью двухмиллилитровой пастеровской пипетки соберите эмбрионы и перенесите их в 90-миллиметровую чашку Петри с примерно 40 миллилитрами системной воды. Под световым микроскопом осмотрите эмбрионы в чашке Петри и удалите те, у которых есть разрыв хориона и признаки повреждения.

После обесцвечивания эмбрионов в соответствии с текстовым протоколом осмотрите и удалите все мертвые эмбрионы, которые могли бы быть окрашены в синий цвет. После того, как эмбрионы были инкубированы в свежем растворе метиленового синего, убедитесь, что у развившихся эмбрионов есть видимые черные глаза. Затем с помощью одноразовой пастеровской пипетки или тонко изогнутого пинцета перенесите эмбрионы на тарелку из фильтровальной бумаги.

Сохраняйте все неразвитые эмбрионы в метиленовом синем цвете и ежедневно наблюдайте за ними. Как только разовьются черные глаза, перенесите их в твердую субстратную среду. С помощью щипцов разложите эмбрионы на расстоянии примерно пяти миллиметров друг от друга, до 100 эмбрионов на 90-миллиметровую пластину.

Затем используйте парафин, чтобы запечатать блюдо, и инкубируйте эмбрионы при температуре 28 градусов Цельсия в течение двух-трех недель, пока они полностью не разовьют золотистые ирисы и не будут готовы к вылуплению. При длительном хранении до одного года, после инкубации в растворе метиленового синего в течение трех дней, перенесите эмбрионы на твердые средние планшеты, как показано выше, и инкубируйте их при температуре 17 градусов Цельсия. Чтобы вылупить рыбок, с помощью тонкого изогнутого пинцета осторожно перенесите от 50 до 100 развитых эмбрионов в инкубационный ящик и полностью погрузите их в раствор гуминовой кислоты не глубже двух сантиметров при четырех градусах Цельсия.

Важнейшим этапом в этом протоколе является вылупление эмбрионов киллифиша, которое достигается путем переноса эмбрионов, инкубированных на сухом субстрате, в раствор для вывода, содержащий гуминовую кислоту, обеспеченный достаточной аэрацией. Накройте инкубационный ящик крышкой и инкубируйте его при температуре 28 градусов Цельсия в инкубационном инкубаторе. Чтобы обеспечить достаточную аэрацию, подключите короб к подаче воздуха с помощью трубки.

Для поддержания надлежащего качества воды в инкубационном боксе один раз в день, начиная со следующего дня после вылупления, пополняйте бокс соотношением воды автоклавной системы, сохраняя конечную глубину в два сантиметра. Перенесите все невылупившиеся эмбрионы обратно в твердый субстрат и попытайтесь вылупиться через неделю. Чтобы вырастить молодь и взрослую рыбу через пять дней после вылупления, переместите молодь в систему рециркуляции воды с помощью одноразовых пластиковых пипеток или пластиковой ложки для осторожного переноса пяти мальков в аквариум объемом 0,8 литра, оборудованный решеткой для жарки 400 микрометров.

В возрасте 14 дней пересадите молодь рыб в аквариум объемом 2,8 литра, оборудованный решеткой для мальков на 850 микрометров. Начиная с этого момента, помечайте каждый аквариум идентификатором рыбы.Для проведения анализов на выживание размещайте каждую рыбу по отдельности в одном аквариуме. Рыбы, выращенные для проведения анализов на выживание, также индивидуально размещаются в аквариуме объемом 2,8 литра.

В течение следующих семи дней кормите молодь два раза в день пятью миллилитрами соленой креветки с добавлением одного-трех живых кровяных червей. В четырехнедельном возрасте кормите каждую рыбу два раза в день артемией и одним миллилитром мотыля. На этом этапе убедитесь, что рыбы достигли полного полового созревания, проверив наличие больших спинных, анальных и хвостовых плавников с признаками окраски у самцов и круглых брюшков, полных икры у самок.

Здесь показана репрезентативная кривая выживания 70 самцов бирюзовой рыбы-убийцы. Правильное содержание приводит к медиане выживаемости в диапазоне от 12 до 28 недель в штамме GRZ. Вариации медианы выживаемости зависят от рациона, частоты кормления и температурных условий содержания.

Кривая выживаемости рыб, выращенных при плохом содержании, показывает увеличение ранней смертности и повторяющиеся внезапные падения выживаемости на протяжении всего времени по сравнению с рыбами, выращенными в оптимальных условиях содержания. Следуя этому протоколу, важно внимательно следить за состоянием воды и избытком пищи от только что вылупившихся мальков, так как важно, чтобы они содержались в чистой среде. После своего развития этот метод проложил путь исследователям к изучению экспериментальных манипуляций с бирюзовыми рыбами-убийцами, включая трансгенез, редактирование генома и диетические манипуляции.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как успешно вырастить бирюзовую рыбу-убийцу в лаборатории и использовать эту модель для изучения биологии старения у самых короткоживущих позвоночных, которых можно вырастить в неволе.