Простой и эффективный метод для в естественных условиях сердечной специфичные генные манипуляции путем инъекций Intramyocardial мышей

Общая цель этой процедуры заключается в достижении кардиоспецифических генных манипуляций in vivo путем инъекции интрамиокардиального аденовируса взрослым мышам. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сердечно-сосудистых исследований о молекулярных механизмах и выравнивании сердечного повреждения, а также об эффективности генной терапии. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что она не требует вентиляции, что мыши быстро восстанавливаются после операции, а также в том, что она воспроизводима и проста в выполнении.

Итак, давайте начнем. В день процедуры очищенный раствор вектора аденовируса подогреть с отрицательных 80 градусов Цельсия, хранить на льду. Когда аденовирус оттает, наденьте маску для лица, стерильный халат и стерильные перчатки.

И опрыскайте аденовирусную трубку с 75% этанолом. Перенесите вирус в стерильный ламинарный вытяжной колпак и аспирируйте 50 микролитров раствора вируса в стерилизованный шприц Гамильтона объемом 50 микролитров. Прикрепите к шприцу иглу 30 калибра.

Переверните шприц в вертикальное положение. Осторожно нажимайте на поршень, пока на кончике иглы не будет видна капля раствора, чтобы наполнить кончик иглы вирусом. Затем осторожно отасуньте в шприц еще 30 микролитров раствора аденовируса, и положите шприц на лед.

Чтобы ввести аденовирус в сердце мыши, подтвердите соответствующий уровень седативного эффекта отсутствием реакции на защемление пальца ноги и нанесите мазь на глаза животного. Побрейте верхнюю часть груди и живот животного. Нанесите имеющийся в продаже крем для депиляции на открытые участки кожи.

С помощью влажной марли удалите крем и оставшиеся волосы через одну минуту. С помощью трех антисептических скрабов на основе хлоргексидина йода, стерилизуйте левую нижнюю часть грудной клетки. Затем накройте животное хирургической простыней, с отверстием, прорезанным над операционной областью, и наденьте новую пару стерильных перчаток.

Далее, используя стерильную технику и инструменты, сделайте разрез кожи на 0,5 сантиметра от мечевидной кости до подмышечной впадины, и с помощью щипцов и кровоостанавливающего средства Micro Mosquito тупо рассеките большую и малую грудные мышцы. Втяните большую и малую грудные мышцы, чтобы обнажить межреберье. И используйте кровоостанавливатель Micro Mosquito, чтобы проткнуть и открыть четвертое межреберье.

Слегка надавите на правую сторону грудной стенки указательным пальцем недоминантной руки, чтобы переместить сердце к разрезу. Затем осторожно закрепите наружное сердце указательным и большим пальцами той же руки, а доминирующей рукой введите по 10 микролитров раствора аденовируса в миокард каждой вентральной, дорсальной и боковой стенок левого желудочка. После последнего укола немедленно верните сердце во внутригрудное пространство.

И аккуратно надавите на грудную стенку в направлении места разреза, чтобы вручную удалить любой воздух из внутригрудного пространства. Закройте кожу шелковым швом в пять отт, в горизонтальном матрасе, и поместите мышь на грелку с температурой 37 градусов Цельсия с контролем до полного восстановления. Затем простерилизуйте использованный шприц Hamilton и иглу 30 калибра в стерилизаторе высокой температуры и высокого давления и выбросьте стерилизованную иглу в соответствующий контейнер для острых предметов.

Через пять дней после интрамиокардиальной инъекции аденовируса, содержащего люциферазу, визуализация in vivo указывает на устойчивую гиперэкспрессию люциферазы, особенно в сердце, что может быть подтверждено вестерн-блоттингом, что свидетельствует об отсутствии трансдукции нецелевого органа. Вестерн-блоттинг также указывает на значительное увеличение экспрессии рецепторов витамина D. А в левый желудочек мышей вводили аденовирус, кодирующий рецептор витамина D.

При сниженной экспрессии рецептора у животных, которым вводили аденовирус, кодирующий короткую шерстяную шпильку, нацеленную на рецептор РНК витамина D. Напротив, экспрессия рецепторов витамина D существенно не изменяется в правых желудочках любого животного, которому вводили инъекцию в левый желудочек. После освоения этот метод может быть завершен в течение двух минут, если он выполнен правильно.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как инъекция сердечных клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как эффективность специфической клеточной терапии при инфаркте миокарда.