Извлечение Hemocytes из личинки Drosophila melanogaster микробной инфекции и анализа
24 мая 2018 г.
Этот метод демонстрируется визуализировать возбудителя вторжения в насекомое клетки с трехмерной (3D) модели. Hemocytes от дрозофилы личинки были инфицированы вирусных или бактериальных патогенов, ex vivo или в естественных условиях. Зараженных hemocytes были затем фиксированной и витражи для изображений с конфокального микроскопа и последующих клеточных 3D реконструкции.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточных инфекций и микробиологии, например, как гемоциты участвуют в общем иммунном ответе у плодовых мушек. Главное преимущество данной методики заключается в том, что ее можно выполнять в лабораторных условиях, используя ранее зараженных личинок. В качестве альтернативы, гемоциты из неинфицированных личинок могут быть использованы для инфекции ex vivo.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы визуализации сложны из-за сложностей конфокального микроскопа и возможностей реконструкции 3D-моделей. Для начала протокола наложите два-три куска парафиновой пленки размером десять на десять сантиметров под стереомикроскоп. Затем подготовьте стеклянный капилляр, установив капиллярный полярный нагреватель на 55% максимума.
Полюс капиллярной трубки доведен до острого острия примерно в десять микрометров. Заполните капилляр минеральным маслом. Соберите заполненную капиллярную трубку на наноинжекторе.
И откройте сросшийся кончик капиллярной трубки, отломив кончик щипцами. Вытолкните как можно больше масла из кончика капиллярной трубки, затем заполните трубку изолирующей средой для гемоцитов дрозофилы, или DHIM. Для легкой визуализации границы гемолимфонового масла включите пузырь воздуха между маслом и DHIM.
С помощью щипцов аккуратно отоберите десять личинок дрозофилы третьего возраста с внутренней стенки флаконов с пищей и поместите их в ситечко размером 100 микрометров. Вылейте на личинок пять миллилитров стерильной воды, и встряхивайте ситечко в течение пяти секунд. Поместите ситечко на салфетку, чтобы удалить лишнюю воду.
Перенесите личинок в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров, обезболите их газом СО2 в течение пяти секунд. Затем поместите личинок на парафиновую пленку под стереомикроскопом тыльной стороной вверх. Слегка поместите стеклянный капилляр на заднее тело личинки, чтобы удержать его на месте, и разорвите заднюю кутикулу с помощью тонкозаостренных щипцов.
Дайте гемолимфе стечь на парафиновую пленку. Сделайте бассейн гемолимфы, в том числе гемоцитов, от 20 до 50 личинок за один раз, на парафиновой пленке. Используйте стеклянный капилляр на наноинъекторе, чтобы забрать накопленную гемолимфу.
Извергните гемолимфу в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 500 микролитров ДХИМ. Выложите дрожжевую пасту на агаровую пластину с виноградным соком. Сделайте на агаре тонкий надрез, куда личинки могут мигрировать, чтобы избежать высыхания.
Соберите заостренную вольфрамовую иглу диаметром 0,001 миллиметра с удерживающими щипцами с помощью парафиновой пленки. Пипеткой нанесите 50 мкл высокого титра, экспрессирующего c.Burnetii на парафиновую пленку под стереомикроскопом, и поместите личинки в бассейн с бактериями. Уколите личинок вольфрамовой иглой.
Переложите личинок на агаровую пластину. Перенесите оставшуюся среду патогена на агаровую пластину и запечатайте пластину парафиновой пленкой. Держите личинок на тарелке во влажном воздухе до нужного времени после заражения.
Оставьте зараженных C.Burnetii личинок на тарелке на 24 часа. Поместите 12-миллиметровый круглый покровный стакан в лунку 24-луночной пластины. Внесите пипеткой 500 микролитров DHIM в лунку.
Извлеките и заберите гемолимфу из ранее зараженных личинок, затем выбросьте гемолимфу в лунку. Центрифугируйте планшет при 1000 G в течение пяти минут. Настройте конфокальный микроскоп для трехцветной визуализации DAPI, EGFP и mCherry.
Поместите образец на микроскоп и сфокусируйтесь на образце с помощью объектива с числовой апертурой 63x 1,4. Найдите нужные гемоциты в поле зрения для визуализации. Затем отрегулируйте мощность лазера и усиление детектора, чтобы добиться соответствующей экспозиции образца.
Проверьте несколько плоскостей Z, чтобы убедиться, что уровень экспозиции соответствует всей толщине образца. Затем найдите верхнее и нижнее положение по оси Z целого гемоцита. Установите эти позиции в качестве начальной и конечной позиций для Z-секционирования.
Используйте сканирующий зум для получения изображения области, содержащей гемоциты. Соберите ряд изображений с соответствующим разрешением, например 1024 на 1024 пикселя в плоскости X Y и с шагом 0,3 микрометра в измерении Z. Импортируйте файл серии изображений с Z-сечением в программное обеспечение, связанное с конфокальным микроскопом, для реконструкции 3D-моделей.
Выберите клетку, показывающую кокализацию ядер, окрашенных DAPI и экспрессирующим mCherry C.Burnetii, в гемоците, экспрессирующем EGFP. Обрежьте серию изображений, чтобы она содержала только одну ячейку. Выберите опцию 3D-просмотрщика, которая реконструирует 3D-модель с использованием предварительно заданного алгоритма программного обеспечения.
Выберите нужный тип изображения для 3D-представления среди вариантов смешивания, поверхности и смешивания. В этом методе гемоциты, ядра и C.Burnetii показаны с использованием поверхностных моделей. Наблюдайте за 3D-реконструкцией ячейки с разных точек зрения, удерживая кнопку мыши и перетаскивая курсор по экрану.
Отрегулируйте ориентацию ячейки и положение моделируемого источника света для оптимизации изображения. Наконец, проведите поперечные сечения по модели с помощью команд обрезки и разреза, чтобы визуализировать внутреннее содержимое гемоцита. Визуализация извлеченных живых гемоцитов, экспрессирующих EGFP под контролем драйвера гемолектина по нескольким изображениям, показывает, что большинство DAPI-положительных клеток также являются EGFP-положительными.
Поперечные срезы гемоцитов, инфицированных Coxiella Burnetii, подтверждают наличие бактерий, экспрессирующих mCherry, внутри клетки. Изображения были реконструированы в 3D-модели, и мы заметили, что инфицированные гемоциты in vivo демонстрируют большее цитоплазматическое расширение и являются более плоскими по своей природе. В то время как ex vivo инфицированные гемоциты были более сферическими.
Поперечные срезы любой модели подтверждают присутствие mCherry-экспрессирующей Coxiella внутри клетки. Извлеченные гемоциты были инфицированы IIV6 и применены к ПЦР-анализу qRT, который показал значительно более высокие уровни транскрипта IIV6-193R между фиктивными и IIV6-инфицированными клетками. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что все среды должны быть заранее подготовлены и сбалансированы до комнатной температуры, чтобы клетки не оставались без необходимых питательных веществ слишком долго.
После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как поиск РНК одиночных клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как общая реакция хозяина на инфекцию. После своего развития этот метод помогает исследователям в области иммунологии и микробиологии изучать инвазию патогенов и реакции хозяина у плодовых мушек или других животных с открытой системой кровообращения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном методе демонстрируется способ визуализации проникновения патогенов в клетки насекомых с использованием трехмерных (3D) моделей. Гемоциты личинок Drosophila заражают вирусными или бактериальными патогенами, что позволяет проводить детальную визуализацию и клеточную реконструкцию.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная инфекция
- Микробиология
- Иммунология
Теоретические сведения
- Гемоциты играют важнейшую роль в иммунном ответе плодовых мушек.
- Понимание механизмов проникновения патогенов может дать представление о работе иммунной системы.
- Данный метод позволяет проводить исследования как ex vivo, так и in vivo.
- Конфокальная микроскопия необходима для получения детальных изображений гемоцитов.
Цель исследования
- Визуализировать взаимодействие между патогенами и иммунными клетками насекомых.
- Углубить понимание иммунных ответов у Drosophila.
- Предоставить протокол для воспроизведения данного исследования другими учеными.
Используемые методы
- Инфицирование гемоцитов вирусными или бактериальными патогенами.
- Фиксация и окрашивание инфицированных гемоцитов.
- Визуализация с помощью конфокального микроскопа.
- 3D-реконструкция клеток на основе данных визуализации.
Основные результаты
- Успешная визуализация проникновения патогена в гемоциты.
- Продемонстрированы сложности методов визуализации.
- Представлен четкий протокол для будущих исследований.
- Подчеркнута важная роль гемоцитов в иммунном ответе.
Выводы
- Данный метод является ценным инструментом для изучения клеточной инфекции.
- Его можно применять в лабораторных условиях с использованием инфицированных личинок.
- Визуальные демонстрации имеют решающее значение для понимания процесса получения изображений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол позволяет напрямую визуализировать инвазию патогена в первичные иммунные клетки, что способствует механистическому снижению рисков на ранних стадиях валидации мишеней для антимикробных или иммуномодулирующих кандидатов. Обеспечивая количественное подтверждение внутриклеточной локализации патогена с помощью методов визуализации, этот подход повышает прогностическую достоверность в рабочих процессах доклинического скрининга. Метод связывает фундаментальную биологию с трансляционной значимостью за счет масштабируемого выделения достаточного количества первичных клеток для последующего молекулярного анализа.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации взаимодействий между патогеном и гемоцитами в релевантной модели заболевания.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством прямого наблюдения за поглощением патогена и его внутриклеточным транспортом.
- Прогностическая ценность: способствует идентификации перспективных соединений-лидеров за счет возможности параллельного сравнения штаммов патогенов или результатов терапевтического воздействия в первичных клетках.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: Обеспечивает стандартизированную подготовку первичных гемоцитов для получения воспроизводимых результатов при проведении анализов инфекции ex vivo.
- Количественные показатели: Позволяет измерять бактериальную нагрузку по интенсивности флуоресценции и проводить 3D-реконструкцию для валидации хитов.
- Масштабируемость: Позволяет выделять до 3 × 10⁶ живых гемоцитов из 200 личинок, что подходит для форматов скрининга средней пропускной способности.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает использование системы, релевантной заболеванию, для оценки механизмов патогенов, имеющих значение для стратегий уклонения от иммунного ответа человека.
- Механистическое снижение рисков: подтверждает внутриклеточную локализацию патогенов, уменьшая неопределенность в механизме действия перспективных противомикробных препаратов.
- Доклиническое согласование: позволяет получить достаточное количество белка и РНК для проведения вестерн-блоттинга и qRT-PCR, что делает возможной оценку биомаркеров и анализ сигнальных путей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса разработки препаратов — от валидации мишени до оптимизации свинцовых соединений, при этом первичные клеточные модели инфекции служат основой для принятия решений при переходе от хитов к свинцовым соединениям.
- Поиск в биологии: Обеспечивает проверку гипотез, позволяя напрямую наблюдать за инвазией патогенов в иммунные клетки в контролируемых условиях.
- Скрининг: Предоставляет воспроизводимые количественные модели инфекции, подходящие для скрининга соединений или генетических пертурбаций.
- Аналитика: Позволяет получать данные на основе визуализации (3D-локализация, колокализация) и молекулярные результаты (qRT-PCR, Вестерн-блоттинг) для многопараметрического анализа.
- Трансляционные исследования: Связывают ранние исследования механизмов с доклинической валидацией через консервативные иммунные пути в открытых кровеносных системах.
- Повторное использование в организации: Создает многоразовую платформу для изоляции первичных клеток, применимую к моделям бактериальных и вирусных патогенов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в патogen-хозяин взаимодействиях за счет однозначной визуализации внутриклеточного проникновения.
- Операционная ценность: Стандартизирует процедуры экстракции гемоцитов и инфицирования, повышая воспроизводимость результатов разными пользователями и в разные моменты времени.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя прямые доказательства взаимодействия патогена с целевыми иммунными клетками.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов с учетом рисков на основе подтвержденной клеточной активности и механизма действия.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с Drosophila, извлечения гемолимфы и конфикальной микроскопии.
- Метод зависит от наличия конфикального микроскопа с возможностью Z-секционирования и 3D-реконструкции.
- Необходима стандартизация среды для изоляции гемоцитов (DHIM) и подготовки патогенов во всех экспериментах.
- Адаптация метода для других видов насекомых может потребовать оптимизации экстракционных буферов и параметров инфицирования.
- Практические ограничения включают необходимость использования свежих личинок и немедленную обработку образцов для поддержания жизнеспособности гемоцитов.
