На основе крови тест для обнаружения ROS1 и ОТСТАВКЕ стенограммы Fusion от циркулирующих рибонуклеиновой кислоты с использованием цифровой полимеразной цепной реакции

Общей целью этой процедуры является выделение и характеристика с помощью капельной цифровой ПЦР циркулирующей рибонуклеиновой кислоты, полученной из опухоли, из образцов цельной крови. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области диагностики онкологии. Например, как обнаружить трансципты слияния генов, полученных от опухоли, из циркулирующей РНК и образцов крови.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что в нем используются высокооптимизированные методы стабилизации, экстракции и обнаружения вариантов РНК, присутствующих в образцах крови с низкой частотой и крови. Анализ крови является дополнением к традиционной биопсии тканей с использованием минимально инвазивного метода, который может обеспечить быстрые результаты. Хотя этот метод может дать представление о клинически значимых мутациях и НМРЛ, он также может быть применен к другим системам, где требуется доступная и быстрая идентификация циркулирующих молекул РНК в цельной крови.

Циркулирующая РНК для реакции обратной транскрипции выделяется из образцов крови доноров, как описано в текстовом протоколе. Преобразуйте образец концентрированной циркулирующей РНК в кДНК с помощью коммерчески доступного набора для реакции обратной транскрипции, включая случайные праймеры. Включите контрольный образец без обратной трансцитазы и контрольный образец без РНК.

Когда реакция обратной транскрипции завершена, выделите кДНК из реакционной смеси с помощью коммерчески доступной спиновой колонки концентратора ДНК. Этот этап способствует удалению ферментов, праймеров и свободных дезоксинуклеотидтрифосфатов. Если кДНК не будет использоваться немедленно в реакциях ПЦР, хранить при отрицательной температуре 80 градусов Цельсия.

Во время выполнения этой процедуры наденьте лабораторный халат и нитриловые перчатки, а также специальную зону подготовки реагентов. Накройте щупы крышкой, чтобы защитить их от света, так как последовательный свет может фотоотбелить флуоресцентный краситель, прикрепленный к щупу. Сначала приготовьте смеси для ПЦР для конечного объема реакции 20 микролитров, как указано в этой таблице, но без добавления кДНК.

Далее перевезите смеси, накрытые и защищенные от света, в чистый колпак для ПЦР, расположенный в отдельной зоне предварительной амплификации. Распределите смеси на ПЦР-планшете. Добавьте тестируемую кДНК в смесь для ПЦР.

Накройте пластину съемным уплотнителем для пластин. Кратковременно центрифугируйте планшеты, чтобы собрать образцы на дне лунок. Перемешивайте в встряхивателе на низкой температуре в течение 10 секунд.

Еще раз кратковременно центрифугируйте планшеты, чтобы собрать образцы на дне лунки. Снимите герметик пластин перед выполнением ручной генерации капель. Важно свести к минимуму образование пузырьков на наконечнике пипетки при загрузке образцов, а затем медленно переносить капли с картриджа на планшет, чтобы предотвратить повреждение капель.

Осторожно перенесите 20 микролитров ПЦР-смеси в лунки для образцов на картридже для генерации капель. Добавьте 70 микролитров масла для генерации капель. Накройте резиновой прокладкой и переведите картридж к ручному каплегенератору, чтобы инициировать генерацию капель.

После генерации капель используйте советы, рекомендованные производителем, для переноса капель на свежую ПЦР-планшет. Отсасывайте и дозируйте капли медленно, в течение 5–6 секунд каждая, не касаясь конца наконечника с картриджем или пластиной для капель. Запечатайте пластину с помощью герметика для пластин из фольги.

Проведите ПЦР в термоамплификаторе с использованием следующих настроек. После завершения работы термоамплификатора считайте показания пластины с помощью считывателя капель. Создание макета пластины для программного обеспечения считывателя, определяющего расположение элементов управления и образцов, и загрузка в программное обеспечение для начала считывания.

Результаты считывания пластин анализируются с помощью коммерчески доступного программного обеспечения. Начните с перехода в меню анализа для просмотра 2-мерных графиков или графиков 2D-амплитуды. Оцените общее качество данных, изучив данные о каплях.

С помощью меню событий оцените данные по общему количеству принятых событий. На одну скважину должно приходиться более 10 000 событий. Если нет, данные должны быть тщательно оценены на предмет дополнительных проблем.

Затем проверьте данные на отвратительные амплитуды флуоресценции. Значительные различия в амплитуде и концентрации между повторяемыми образцами указывают на плохую обработку или смешивание образцов. Обратите внимание на скопления капель с распылением под углом 45 градусов, что указывает на низкое качество капель или проблемные образцы.

Сначала изучите данные на предмет положительного контроля, отсутствия контроля обратной транскриптазы и контроля РНК. Выберите все контрольные образцы и проверьте качество кластера с помощью 2D-графика для правильного порогового значения, должно быть очевидно четкое разделение между кластерами капель. Для каждого варианта анализа установите пороговое значение на основе контрольных лунок.

Установите пороговые значения на 2D-графиках с помощью инструментов перекрестия, чтобы отделить популяцию двойных отрицательных капель от популяции контрольных генов по оси x и популяцию вариантов генов, если таковая присутствует, по оси y. Несколько копий с каждого репликанта хорошо для одного образца. Наконец, выразите результаты теста в виде количества обнаруженных вариантов вариантов.

С использованием клеточных линий, экспрессирующих слияние SDC4-ROS1 и слияние CCDC6-RET, разбавленных на фоне общего количества РНК дикого типа человека, предел обнаружения установлен на уровне 0,2% частоты вариантов с каждым вариантом слияния. Препарат 5-процентного происхождения РНК из клеточной линии-мишени не был обнаружен, что свидетельствует о специфичности анализа. Стандарты аналитической мультиплексной РНК измерялись при высоких, средних и низких концентрациях в течение трех прогонов в один и тот же день.

Три запуска в течение трех дней подряд и с двумя независимыми операторами. Результаты демонстрируют точное обнаружение как представляющего интерес транскрипта слияния, так и гена внутреннего контроля GUSB. Каждый бах клинических образцов также проводили с положительным контролем, контролем без обратной транскриптазы и контролем без матрицы РНК.

Варианты Fusion представлены по оси y, в то время как GUSB находится по оси x. Когда контрольная партия оценивалась в течение 21 дня, положительные капли и капли контрольного гена GUSB наблюдались для ROS1 и RET во всех прогонах. Представители показывают неоптимальные результаты при наличии контаминации в контроле без обратной транскриптазы, контаминации в контроле без РНК, совместном использовании и слиянии капель, а также при плохо оптимизированных условиях ПЦР или ингибировании ПЦР.

После освоения весь этот протокол может быть выполнен примерно за 12 часов. При попытке выполнить эту процедуру важно использовать передовые методы работы с РНК и образцами человеческой крови. После выделения РНК могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование нового поколения, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как идентификация новых вариантов слияния.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделить циркулирующую РНК из цельной крови и плазмы, а затем обработать восстановленную РНК с целью выявления редких вариантов в циркуляции, таких как RET и ROS1. После своего развития этот метод проложил путь к обнаружению клинически действенных мутаций из цельной крови. И мы расширили эти методы, чтобы исследовать сверхэкспрессированные транскриптов, находящиеся в обращении.