Иммунопреципитации Chromatin (чип) изменения гистона от Saccharomyces cerevisiae

Общая цель этого протокола иммунопреципации хроматина заключается в определении распространенности и локализации модификаций гистонов в определенных областях по всему почковающемуся геному дрожжей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы регуляции хроматина, например, как модификации гистонов связаны с контролем экспрессии генов и как эти модификации изменяются в ответ на различные условия окружающей среды. Чрезвычайно универсальный протокол, который может быть использован для исследования множества различных модификаций гистонов и нескольких штаммов Е одновременно.

Хотя этот метод может дать представление о модификациях гистонов, он также может быть применен для исследования других белков, связывающих хроматин, с помощью эпитопных меток или доступных антител. Начните эту процедуру с выращивания дрожжевых клеток: инокулируйте 10 миллилитров среды YPD с одной колонией каждого подходящего штамма и вырастите ее при температуре 30 градусов Цельсия в встряхивающем инкубаторе при 220 оборотах в минуту в течение ночи. На следующий день после измерения оптической плотности на 600 нанометрах или OD600 культуры разбавьте культуру до OD600 0,2 на 100 мл YPD в новой колбе.

Выращивайте клетки при температуре 30 градусов Цельсия в встряхивающем инкубаторе со скоростью 220 об/мин, пока они не достигнут середины логарифмической фазы. Когда культуры достигнут середины логарифмической фазы, добавьте 2,7 миллилитра 37% формальдегида непосредственно в среду в каждой колбе для окончательной концентрации 1% формальдегида. Переложите колбы в шейкер комнатной температуры, и встряхивайте при 50 об/мин в течение 15 минут.

Добавьте в среду пять миллилитров 2,5 молярного глицина и продолжайте встряхивать при 50 об/мин при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы погасить формальдегид. Впоследствии раскрутите клетки вниз и промойте их, как описано в текстовом протоколе. Удалите надосадочную жидкость после последнего отжима и приступайте к изготовлению лизатов дрожжей.

Повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре холодного осаждения хроматина или буфера для лизиса ChIP с 1 миллимолярным PMSF и 1:1000 в разведении коктейля ингибиторов протеазы дрожжей. Переложите суспензию в тюбик с завинчивающейся крышкой объемом 2,0 миллилитров, содержащий 200 микролитров стеклянных шариков. Перенесите ячейки в устройство для взбивания бусин для высокоскоростного перемешивания при температуре четыре градуса Цельсия.

Взбивайте бусины в течение 30 секунд и лед в течение одной минуты. В общей сложности шесть ударов бусинами, удерживая клетки на льду не менее одной минуты между каждыми 30-секундными ударами. С помощью гелевого насадочного наконечника перенесите лизат в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Центрифугируйте лизат при 15, 500 г при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 250 микролитрах буфера для расщепления микрококковой нуклеазы, осторожно пипетируя вверх и вниз. Добавляйте по 2,5 микролитра микрококковой нуклеазы в каждую реакцию.

Аккуратно перемешайте, перевернув четыре-шесть раз, и немедленно выдержите на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. Через 20 минут остановите реакцию, поместив пробирки на лед, добавив пять миллилитров 0,5 молярной ЭДТА для конечной концентрации 10 миллимолярных ЭДТА и осторожно перемешав путем инверсии. Центрифугируйте при 15, 500 г при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.

Затем переложите каждую надосадочную жидкость в новую 1,5-миллилитровую трубку. Для получения наиболее стабильных результатов крайне важно убедиться, что в каждой аминокислотной осадке используется одна и та же концентрация белка. В зависимости от количества аминопреципитации или реакций IP, сделайте мастер-смесь из каждой микрококковой нуклеазы высвобождаемой хроматиновой фракции и буфера для лизиса ChIP и распределите один миллилитр, содержащий 50 микрограммов общего белка, по отдельным пробиркам.

Удалите 100 микролитров из каждой смеси IP, чтобы обработать ее в качестве входного образца. Заморозьте входные образцы при температуре 20 градусов Цельсия для последующего использования. Также важно убедиться, что для каждого иммунопреципитации используется одинаковое количество гранул, связанных с антителами.

С помощью широкого наконечника для пипетки добавьте 20 микролитров магнитных гранул белка AG, предварительно связанных с антителами, в каждый образец IP. Вращайте образцы со скоростью восемь оборотов в минуту при четырех градусах Цельсия в течение трех часов. Когда IP будет готов, поместите трубки на магнитную подставку и дайте бусинам собраться на боковой стороне трубки.

С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость. Добавьте один миллилитр буфера для лизиса ChIP к шарикам и вращайте со скоростью восемь оборотов в минуту при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем поместите трубки на магнитную подставку и удалите надосадочную жидкость.

Таким образом, последовательно промойте бусины следующими буферами в указанном количестве. Буфер для лизиса ChIP, буфер для стирки с высоким содержанием соли, буфер для стирки LiCl/моющего средства и TE. При последней промывке TE используйте 0,5 миллилитра TE, чтобы перенести большую часть бусин в новую пробирку, а затем используйте еще 0,5 миллилитра TE, чтобы промыть трубку и перенести оставшиеся бусины. Добавьте 250 микролитров свежеприготовленного элюирующего буфера ChIP в каждую пробирку и быстро

Вращайте образцы со скоростью восемь оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 15 минут. Поместите трубки в магнитную подставку. Осторожно переложите надосадочную жидкость в новую пробирку и избегайте попадания шариков.

Добавьте в бусины еще 250 микролитров элюирующего буфера ChIP. Вращайте образцы со скоростью восемь оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 15 минут. Аккуратно, не тревожа бусины, перенесите надосадочную жидкость в пробирку, содержащую первое элюирование.

Разморозьте собранные ранее входные образцы и добавьте 400 микролитров элюирующего буфера ChIP в каждую входную пробу. Чтобы обратить вспять поперечные связи белковой ДНК, добавьте к входным образцам и образцам IP 20 микролитров пяти моляров хлорида натрия, пять микролитров гликогена и 12,5 микролитров протеиназы K. Хорошо перемешайте, перевернув или перевернув пробирки. Инкубируйте образцы на водяной бане при температуре 65 градусов Цельсия в течение ночи.

Чтобы начать эту процедуру, составьте мастер-смесь QPCR для каждого набора грунтовок, объединив соответствующие объемы смеси QPCR, прямого праймера и обратного праймера. Сделайте мастер-смеси ДНК для каждого образца ДНК, где одна реакция содержит 0,5 микролитра ДНК и 4,0 микролитра воды, свободной от нуклеаз. Добавьте 5,5 микролитров соответствующей мастер-смеси праймера в каждую лунку в 384-луночной чашке QPCR. Закрутите тарелку при температуре 200 г при комнатной температуре в течение одной минуты.

Затем добавьте по 4,5 микролитра соответствующей мастер-смеси ДНК в каждую лунку. Закройте пластину и отжимайте при температуре 200 г при комнатной температуре в течение одной минуты. Выполните QPCR с использованием системы QPCR в реальном времени со следующими условиями: 95 градусов Цельсия в течение трех минут, 40 циклов 95 градусов Цельсия в течение 10 секунд и 55 градусов Цельсия в течение 30 секунд и кривая плавления от 65 до 95 градусов Цельсия с шагом 0,5 градуса Цельсия в течение пяти секунд.

Одним из ключевых компонентов этого протокола является оптимизация концентрации микрококковой нуклеазы, используемой для расщепления хроматина в растворимые фрагменты. Этот пример результата электрофореза в агарозном геле ДНК, выделенной после расщепления гранулы хроматина с различными количествами микрококковой нуклеазы, показывает, что 2,5 микролитра фермента в концентрации 20 единиц на микролитр продуцируют преимущественно мононуклеосомы. В этом репрезентативном эксперименте ChIP использовались антитела против гистонного метилового маркера H3K4me2 и гистона H3 в клетках с нокаутом дикого типа и set1.

В нокаутных клетках Set1 отсутствует метилтрансфераза, катализирующая метку Столбцы указывают на относительное обогащение H3K4me2 при указанном низком уровне sci. Штамм дикого типа продемонстрировал явное обогащение H3K4me2 на пяти основных концах двух генов, которые, как известно, являются прямыми мишенями set1, PMA1 и ERG11, в то время как в клетках с нокаутом set1 сигнал не наблюдался. Как и ожидалось, в TEL07L не было обогащения метки H3K4me2, экспрессия SPR3 также регулировалась набором 1, но эти результаты указывают на то, что регуляция, вероятно, происходит по другому механизму, чем при PMA1 или ERG11.

После освоения этой техники ее можно выполнить в течение четырех дней, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о тщательном тестировании используемых антител на специфичность с помощью соответствующего контроля. Если это возможно, в QPCR следует исследовать как положительные, так и отрицательные контрольные области.

После этой процедуры также могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование GP, чтобы определить геном по распределению модификаций гистонов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как последовательно определять уровни различных модификаций гистонов в уникальных областях генома с помощью хорошо контролируемых экспериментов.