Фракционирование резолюции растворимых и нерастворимых гентингтина видов
27 февраля 2018 г.
Для фракционирования растворимых и нерастворимых мутант гентингтина видов от мыши мозга и клетки культуры описан метод. Метод, описанный полезен для характеристик и количественной оценки потока белок гентингтин и СПИДа в анализе белка гомеостаза в патогенезе заболевания и при наличии возмущений
Общая цель данной процедуры состоит в том, чтобы описать полезный инструмент для визуализации, характеристики и количественной оценки потока белка гентингтина для анализа белкового гомеостаза в модельных системах болезни Хантингтона. Этот метод может помочь нам понять вопросы в области белкового гомеостаза и нейродегенеративных заболеваний, такие как понимание влияния определенных терапевтических вмешательств на патогенез заболевания. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет исследователям выделять и разрешать нерастворимые виды белка для количественного анализа.
Хотя этот метод может дать представление о биохимических изменениях во время патогенеза болезни Хантингтона, он также может быть применен к другим заболеваниям с неправильным сворачиванием белка, таким как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера. Чтобы начать эту процедуру, пометьте два комплекта пробирок для каждого образца как растворимые и нерастворимые. Приготовьте буфер для лизиса непосредственно перед лизисом образца в растворимой пробирке, добавив соответствующее количество ингибиторов.
Затем добавьте в ткани ледяной рабочий растворимый буфер для лизиса, дополненный ингибиторами протеазы. Для мозговой ткани мыши, медленно опустите 30 раз в стеклянный наконечник объемом один миллилитр. Будьте осторожны, чтобы не разбить поверхность жидкости, так как будут образовываться пузырьки, которые могут привести к неполной гомогенизации.
Затем введитеего пипеткой в нерастворимую пробирку со льдом. Для клеточных линий клетки были покрыты в соотношении пять умно-10 на пятую клетку в каждой шестилуночной пластине и выращены до состояния, близкого к слиянию. После этого промойте клетки один раз холодным 1X PBS и удалите его.
Затем нанесите на клетки минимальный объем буфера для лизиса и приподнимите их с помощью скребка для клеток. Затем перенесите гомогенат или лизат клеток в меченую нерастворимую пробирку и лизируйте на льду в течение одного часа. Для клеточных лизатов растирайте несколько раз, чтобы разбить клеточные сгустки перед началом инкубации и избежать образования пузырьков.
Кратковременно импульсируйте вихревой импульс каждого образца в течение одной секунды на полпути к лизингу. После этого центрифугируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия при 15 000 х г в течение 20 минут. Затем удалите надосадочную жидкость.
Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулы или мутный слой, так как это загрязнит фракцию. Внесите надосадочную жидкость в виде растворимой фракции в пробирку с растворимой меткой и держите ее на льду. Ключевым моментом является отслеживание растворимых и нерастворимых лизисных буферов.
Замена буферов или помещение нерастворимого буфера или образцов на лед нанесет ущерб результатам протокола. Промойте гранулу 500 микролитрами буфера для лизиса и центрифугируйте при четырех градусах Цельсия при 15 000 х г в течение пяти минут. Повторите стирку еще раз.
Впоследствии удалите все остатки промоющего буфера, оставив только тканевые гранулы. Далее суспендируйте гранулу лизисным буфером с добавлением 4% SDS. Обрабатывайте каждый образец ультразвуком в течение 30 секунд при комнатной температуре с помощью зондового ультразвукового аппарата.
Ультразвуковая обработка небольших объемов в течение длительного периода времени является технически сложной задачей. Будьте осторожны, чтобы не потерять образец из-за эмульгирования или распыления во время выполнения этого шага. После этого прокипятите образцы в течение 30 минут.
Затем кратковременно центрифугируйте их при 6 000 x g. Затем проведите анализ белка, совместимого с детергентом, или анализ белка Лоури для измерения концентрации белка. После этого распределите образцы по 50 микролитров, чтобы избежать проблем с замораживанием/размораживанием.
На этом этапе выполните вестерн-блоттинг, разбавив 30 мкг образца в соотношении один к одному в загрузочном буфере. Прокипятите образцы в течение пяти минут и кратковременно центрифугируйте их при 6 000 x g. Далее проанализируйте дроби по странице SDS и вестерн-блоту.
Покрасьте мембрану красителем из цельного белка, чтобы визуализировать эффективность загрузки белка. Ниже приведены растворимые и нерастворимые фракции из лизатов клеток HEK 293T, разложенные на 4-12% гелях Bis-Tris и 3-8% Tris-Acetate соответственно. Растворимая фракция, нормализованная по контролю нагрузки GAPDH, показывает флуктуацию мутантного растворимого мономера экзона 1 гентингтина на основе воздействия ингибитора протеазы MG132.
Нерастворимая фракция показывает, что накопленные с высокой молекулярной массой частицы мутантного гентингтина также модулируются обработкой MG132. А вот образцы растворимых и нерастворимых фракций из клеточных лизатов HeLA с использованием вестерн-блоттинга и фильтрационного анализа. Данные показывают, что присутствие сверхэкспрессированной изоформы SUMO увеличивает как высокомолекулярный мутантный, так и фибриллярный нерастворимый мутантный гентингтин в нерастворимой фракции.
На этом рисунке показана регуляция накопления высокомолекулярного мутантного гентингтина после модуляции потенциального терапевтического препарата в нерастворимом фракционировании из клеток HeLa по экспрессии экзона 97Q гентингтина 1. Терапевтическая мишень PIAS1 либо подавлялась миРНК в направлении PIAS1, либо чрезмерно экспрессировалась. Нерастворимые фракции стриаты мыши, обработанные микроРНК против PIAS1 и разрешенные на 3-8% трис-ацетатных гелях, демонстрируют модуляцию высокомолекулярного нерастворимого гентингтина.
Не забывайте, что работа с NEM может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этого протокола всегда следует принимать меры предосторожности, такие как ношение маски для лица. После освоения эта техника от лизата до конца фракционирования может быть выполнена примерно за три-четыре часа в зависимости от количества образцов. Следует выделить дополнительный час для количественного определения белка и аликвотирования.
После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как электрофорез в агарозном геле или замедление фильтра, чтобы обнаружить растворимые олигомеры или нерастворимые фибриллы соответственно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять и разрешать нерастворимые неправильно свернутые белки для количественного анализа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод фракционирования нерастворимых и растворимых форм мутантного хантингтина из мозга мыши и клеточных культур. Этот метод помогает в характеристике и количественном определении потока белка хантингтина, что способствует анализу белкового гомеостаза при болезни Гантингтона и других нейродегенеративных заболеваниях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Нейродегенеративные заболевания
Теоретические сведения
- Белок хантингтин играет важную роль в развитии болезни Гентингтона.
- Понимание механизмов белкового гомеостаза имеет решающее значение для изучения патогенеза заболевания.
- Нарушение фолдинга белков является общим признаком различных нейродегенеративных заболеваний.
- Данный метод также может быть применен для изучения болезней Паркинсона и Альцгеймера.
Цель исследования
- Предоставить инструмент для визуализации и количественной оценки потока белка хантингтина.
- Проанализировать белковый гомеостаз в модельных системах болезни Гентингтона.
- Оценить влияние терапевтического вмешательства на прогрессирование заболевания.
Используемые методы
- Выделение растворимых и нерастворимых фракций белков.
- Приготовление буфера для лизиса с соответствующими ингибиторами.
- Количественный анализ потока белков.
- Применение метода к различным моделям нейродегенеративных заболеваний.
Основные результаты
- Данный метод позволяет эффективно изолировать виды белка хантингтина.
- Количественный анализ дает представление о гомеостазе белков.
- Полученные результаты способствуют пониманию механизмов заболевания.
- Метод обладает потенциалом для более широкого применения при изучении заболеваний, связанных с неправильным сворачиванием белков.
Выводы
- Данный метод является ценным инструментом для изучения болезни Гентингтона.
- Он углубляет понимание динамики белков при нейродегенерации.
- В дальнейшем этот подход может быть применен для изучения других родственных заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет командам по биофармацевтическим исследованиям и разработкам количественно разделять растворимые и нерастворимые формы мутантного хантингтина, что дает понимание механизмов протеостаза в моделях болезни Гентингтона. Путем выделения значимых для заболевания высокомолекулярных агрегатов, которые коррелируют с фенотипическими показателями и терапевтической модуляцией, данный подход способствует валидации мишеней и снижению рисков при реализации стратегий модуляции HTT. Он представляет собой адаптируемый рабочий процесс, применимый для культур клеток, тканей и других контекстов нейродегенеративных заболеваний, что повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать поток мутантных форм HTT для выяснения патогенных механизмов и подтверждения HTT в качестве терапевтической мишени.
- Операционная ценность: Обеспечивает количественную оценку пулов растворимого и нерастворимого HTT для анализа взаимодействия с мишенью и модуляции сигнального пути.
- Прогностическая ценность: Способствует приоритизации портфеля препаратов путем установления связи между биохимическими изменениями форм HTT, прогрессированием заболевания и терапевтическим ответом.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: позволяет получать стандартизированные растворимые и нерастворимые фракции, подходящие для последующего вестерн-блоттинга, фильтрационного анализа или анализа на наличие олигомеров.
- Количественный выход: обеспечивает точное измерение концентрации форм HTT с помощью белковых анализов, совместимых с детергентами, что позволяет проводить анализ зависимости «доза-ответ» и анализ временной динамики.
- Воспроизводимость: четко определенные этапы лизиса, центрифугирования и промывки обеспечивают стабильное фракционирование различных типов образцов, что облегчает перенос метода и его межфункциональное использование.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболевания: Позволяет выделять высокомолекулярные формы HTT, которые коррелируют с поведением мышей и модулируются терапевтическими воздействиями, что обеспечивает установление связи между фенотипом и механизмом.
- Трансляционная преемственность: Поддерживает переход от моделей in vitro к валидации на тканях, согласовывая результаты поисковых исследований с оценками доклинической эффективности.
- Снижение механистических рисков: Позволяет уточнить, воздействуют ли вмешательства на растворимые мономеры, олигомеры или нерастворимые агрегаты, что уменьшает неопределенность в понимании механизма действия.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в этап раннего поиска, позволяя проверять гипотезы о стратегиях воздействия на HTT перед идентификацией перспективных соединений и доклинической валидацией, предоставляя количественные данные о гомеостазе белков на основе фракционирования.
- Биология открытий: обеспечивает возможность изучения механизмов процессинга, агрегации и путей клиренса HTT в моделях заболеваний.
- Скрининг: позволяет подготавливать биохимически определенные фракции для надежного скрининга соединений против растворимых или нерастворимых форм HTT.
- Аналитика: предоставляет количественные данные о концентрации белков и результаты вестерн-блоттинга для сравнения уровней различных форм HTT в разных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает фракционирование HTT на уровне клеток и тканей с поведенческими и патологическими показателями в доклинических моделях.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для изучения неправильного фолдинга белков в моделях болезни Гентингтона, болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает уверенность в выборе мишени за счет выявления специфического вклада различных форм HTT в патогенез и терапевтический ответ.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированным рабочим процессам лизиса, фракционирования и количественного определения белков.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) путем установления связи между модуляцией мишени и измеримыми изменениями в агрегатах HTT, значимых для заболевания.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию кандидатов, снижающих уровень HTT или модулирующих агрегацию, с учетом рисков на основе сокращения количества нерастворимых форм.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области биохимии белков, методов фракционирования и вестерн-блоттинга.
- Необходим доступ к центрифуге, соникатору и соответствующим реагентам, включая SDS и ингибиторы протеаз.
- Требуется применение стандартизированных протоколов во всех группах для предотвращения перекрестного загрязнения буферами и обеспечения чистоты фракций.
- При масштабировании исследования на разных моделях необходимо учитывать вариабельность эффективности гомогенизации тканей и соникации.
- Ограничением является необходимость осторожного обращения с образцами во избежание их потерь на этапах соникации и ресуспендирования, особенно при работе с малыми объемами.
