Культивирование клеток эпителия сетчатки пигментного модель Ex Vivo мембраны Бруха возрасте человека на

Общей целью этой экспериментальной процедуры является создание ex vivo-внеклеточного матрикса, известного как система культивирования мембраны Бруха, которая наблюдает за эффектом мембраны Бруха на перекрывающие пигментные эпителиальные клетки сетчатки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы суббиологии РПЭ в области этиологии ВМД, например, способствуют ли изменения на стареющих мембранах Бруха сбоям в работе перекрывающих клеток РПЭ. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет выделить нативную мембрану Бруха из глаза человека-донора разного возраста и использовать их для протеомного исследования в культурах клеток РПЭ.

Изолировать мембрану Бруха и создать настоящую систему культивирования vivo с минимальным повреждением нативной мембраны Бруха — сложная задача, но я покажу вам, как это сделать, в этом видео. Для начала поместите марлю площадью 1,5 квадратного дюйма, смоченную в CO2-независимом DMEM, в 100-миллиметровую посуду. Затем загрузите глазной шар на марлю.

Далее с помощью хирургического лезвия сделайте разрез через склеру на три миллиметра позади лимба. Затем с помощью ножниц с тонким лезвием сделайте разрез на всю толщину и продлите разрез по окружности в любом направлении вокруг глаза. Затем удалите и выбросьте передний сегмент, включая роговицу, хрусталик и радужную оболочку.

Также откажитесь от стекловидного тела и сетчатки. Затем осторожно отклейте мембранный сосудистый комплекс Бруха RPE от склеры от периферии к зрительному нерву с помощью шпателя с тефлоновым покрытием. Делать это нужно очень аккуратно, чтобы не порвать мембранный комплекс.

Теперь с помощью тонких хирургических ножниц сделайте четыре радиальных разреза в склере и снимите склеру. Затем отрежьте мембранный эксплант сосудистой оболочки Бруха от зрительного нерва и перенесите этот эксплант в 60-миллиметровую чашку, содержащую 0,02 молярного гидроксида аммония в DPBS. Чтобы удалить нативные клетки РПЭ, инкубируйте этот эксплант в течение 20 минут при комнатной температуре.

После инкубации трижды промыть эксплант с помощью DPBS, закрепив участок оптического нерва на мембране Бруха щипцами с тефлоновым покрытием при одновременном обтекании тканей раствором. Затем поместите эксплант ламининовой стороной вверх в среду, не содержащую углекислого газа. Сделайте четыре разреза на мембране Бруха, затем перенесите неслоистую гидрофобную мембрану из ПТФЭ толщиной 65 микрон с порами 0,2 микрона на эксплант.

Установите его так, чтобы базальная пластинка прилегала к мембране из ПТФЭ. Удалите лишнюю жидкость из чашки, затем перенесите сборку в стеклянную систему держателей вакуумного фильтра для микроанализа, где она должна находиться на подставке из фриттованного стекла. Далее, тщательно избегая контакта с базальной пластинкой, сгладьте загнутые края сосудистой оболочки с помощью щипцов с тефлоновым покрытием.

Теперь разжижьте 15 миллилитров 4%-ной агарозы в DPBS и охладите его до 37 градусов по Цельсию. Затем медленно вылейте агарозу на хориовидную сторону экспланта, применяя при этом мягкое всасывание, чтобы он оставался плоским. Как только гель начнет застывать, перенесите его вместе с мембраной в 60-миллиметровую посуду на льду.

Дайте гелю застыть в течение двух-трех минут, а затем снимите мембрану из ПТФЭ. Затем погрузите эксплант в DPBS и храните его при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока это не понадобится. При культивировании экспланта на 60-миллиметровой посуде, выстланной жидкостью 4%-ной агарозы, сделайте мембрану Бруха лицевой стороной вверх.

При культивировании с использованием 96-луночной пластины с полистирольной футеровкой поместите мембранный эксплант Бруха в гелевидной оболочке на плоский тефлоновый лист стороной ламинина вверх. Затем с помощью трепана вырезаем от шести до восьми шестимиллиметровых пуговиц из экспланта и переносим тканевые пуговицы в лунки, загруженные жидкой агарозой. Для начала установите глазной шар на марлю, пропитанную DPBS, как и раньше.

Затем сделайте круговой разрез на пять миллиметров ниже точки соприкосновения радужки и склеры, pars plana, в субретинальное пространство. Откажитесь от внутреннего сегмента, стекловидного тела и сетчатки глаза. Далее с помощью переводной пипетки промойте наглазник двумя-тремя миллилитрами холодного DPBS.

В общей сложности промойте наглазник три раза. Затем, чтобы диссоциировать клетки РПЭ, обрабатывают наглазник трипсином в течение 10 минут. Затем перенесите трипсинизированные клетки РПЭ в 50-миллилитровую пробирку, а для гашения реакции добавьте 25 миллилитров среды с FBS при температуре 37 градусов Цельсия.

Теперь центрифугируйте ткань и раствор при плотности 200 г в течение 10 минут при температуре 24 градуса Цельсия. Затем повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах полной среды DMEM с 15% FBS. Теперь подсчитайте клетки и поместите 15 000 жизнеспособных клеток RPE в 200 микролитры бессывороточной минимально необходимой среды, содержащей антибиотики, на каждую кнопку мембраны Бруха в 96-луночном планшете.

Культивируйте клетки в течение не менее 24 часов для прикрепления. Позже аккуратно смените среду на теплую полную DMEM и продолжайте культивирование клеток. Используя этот протокол, можно изучать стареющие и больные мембраны Бруха человека, выращивая на них клетки RPE.

Как правило, у старых эксплантов снижается реприкрепление клеток RPE. Клетки РПЭ, культивируемые на мембране Бруха у стареющего человека, также менее способны фагоцитировать наружные сегменты палочек, что является критически важной функцией РПЭ. С помощью микрочипов было обнаружено, что экспрессия генов клеток RPE отличается при культивировании клеток на мембране Бруха у пожилых особей по сравнению с клетками, культивируемыми на мембране у более молодых особей.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать мембрану Бруха от глаз человека-донора и получить экспланты, в которых можно культивировать клетки RPE. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за три часа, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нельзя прикасаться к ламининовой стороне мембранного экспланта Бруха режущими инструментами, чтобы не повредить поверхность.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как фагоцитоз RPE и исследования экспрессии генов клеток RPE, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, будет ли мембрана Бруха от донора разного возраста или доноров с возрастной макулярной дегенерацией влиять на функции вышележащих клеток RPE. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области возрастной макулярной дегенерации к изучению механизма этиологии ВМД в модельной системе мембраны Бруха ex vivo.