Imaging промежуточных филаментов и микротрубочек с 2-мерной прямой стохастических оптических реконструкции микроскопия
6 марта 2018 г.
Общая цель этой методологии является дать оптимальных экспериментальных условиях от Пробоподготовка для захвата изображений и восстановления для выполнения 2D двойной цвет изображения dSTORM микротрубочки и промежуточные филаменты в фиксированных ячейках
Общая цель данной методологии заключается в создании оптимальных экспериментальных условий от подготовки образца до получения изображения и реконструкции для выполнения двухцветной визуализации микротрубочек и промежуточных филаментов в фиксированных клетках с помощью двухцветного D-STORM. Этот метод может помочь охарактеризовать физические взаимодействия между плотными и сложными цитоскелетными сетями, такими как промежуточные филаменты и микротрубочки. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет наблюдать клеточные структуры, которые не разрешаются с помощью обычной флуоресцентной микроскопии.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку контроль подготовки образцов и получение данных, связывающих мот, имеет решающее значение для ограничения генерации артефактов. После выращивания клеток U373 в соответствии с текстовым протоколом зафиксируйте клетки, сначала промыв их один раз с помощью PBS. Затем снимите PBS и добавьте один миллилитр на лунку предварительно нагретого раствора для фиксации экстракции.
Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 60 секунд. Затем раствор удалить и добавить по одному миллилитру на лунку свежеприготовленного и разогретого 4%-ного ПФА, разведенного в цитоскелетном буфере. Поместите планшет на 12 лунок обратно в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 10 минут.
Затем удалите PFA и добавьте три миллилитра PBS на лунку. Используйте PBS для промывки клеток дважды. Затем удалите PBS и добавьте свежеприготовленный 10 миллимоларов борогидрида натрия, разведенный в PBS, чтобы погасить автофлуоресценцию из глутарового альдегида.
Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение семи минут и перенесите переработанный борогидрид натрия в специальный контейнер. Используйте PBS для промывания лунок три раза по пять минут каждый. Затем удалите PSB и добавьте 5% BSA в PBS в качестве блокирующего раствора.
После иммуноокрашивания образцов и приготовления растворов в буферах согласно текстовому протоколу смонтируйте покровное стекло, содержащее меченые клетки, на магнитный держатель образца. И добавьте буфер для визуализации, чтобы полностью заполнить камеру. Закройте крышку и убедитесь, что между буфером изображения и крышкой нет пузырьков воздуха.
Используя абсолютный этанол, очистите дно образца и убедитесь в отсутствии утечек. Затем, при необходимости, используйте смазку, чтобы правильно герметизировать удержание пробы. Для выполнения визуализации включите микроскоп и программное обеспечение для сбора данных.
Настройте параметры сбора данных в соответствии с текстовым протоколом, используя объектив NA 1.46 со 100-кратным увеличением, объектив Optivar с коэффициентом 1.6 и режим UHP TIRF. Создайте дорожку 647 для изображения нитей виментина, помеченных Alexa Fluor 647. Выберите лазерные линии 405 и 642 нанометров, а также эмиссионный фильтр LP 655.
Затем создайте дорожку 555 для изображения микротрубочек, помеченных Alexa Fluor 555. Выберите лазерные линии 561, 488 и 405 нанометров для получения изображения флуорофоров и эмиссионный фильтр BP от 570 до 650. Далее заливаем объектив маслом и помещаем образец на объектив.
Затем выберите вкладку «Найти» и откройте затвор люминесцентной лампы. Найдите фокус и с помощью окуляра найдите ячейки для изображения. Затем с помощью джойстика расположите ячейки в центре поля.
Нажмите на вкладку сбора данных, чтобы вернуться в режим сбора данных. Затем выберите дорожку 647 и установите мощность лазера 642 на 0,2%, а мощность лазера 405 на минимальное значение. Установите время экспозиции на 50 миллисекунд и усиление на 50.
Затем выберите режим непрерывного сбора данных, чтобы наблюдать за ячейкой на экране. Убедитесь, что в поле зрения есть хотя бы одна флуоресцентная бусина. Используйте режим автомасштабирования для дисплея и отрегулируйте фокусировку.
Затем сделайте широкопольное эпифлуоресцентное изображение сети виментина, нажав на кнопку «Прикрепить», и сохраните изображение. Чтобы проверить освещенность TIRF, нажмите на TIRF, нажмите непрерывно, отрегулируйте параметры сбора данных, чтобы получить однородное поле освещения. Затем нажмите кнопку «Привязать» и сохраните изображение.
Проверьте трассу 555. Снимите галочку с дорожки 647 и выберите дорожку 555. Сделайте эпифлуоресцентное изображение сети микротрубочек и сохраните его.
Затем сделайте снимок TIRF и сохраните его. Теперь проверьте колею 647. Снимите галочку с дорожки 555 и выберите дорожку 647.
Установите усиление на ноль, а время экспозиции на 10 миллисекунд. Затем нажмите непрерывно. Установите мощность лазера 642 нанометра на 100%, чтобы накачать большинство красителей Alexa 647 в темное состояние.
Как только флуорофоры начнут мигать, увеличьте воздействие до 15 миллисекунд, а усиление до 300. Используйте режим индикатора диапазона, чтобы убедиться, что сигналы одной молекулы не насыщают камеру, как показано красным цветом. В этом случае уменьшайте усиление до тех пор, пока насыщенность не исчезнет.
Бусины останутся насыщенными в начале приобретения. Нажмите стоп, чтобы прекратить наблюдение за камерой. Разверните инструмент онлайн-обработки и щелкните PALM для онлайн-обработки, чтобы визуализировать изображение STORM во время съемки.
Используйте девять для пикового размера маски и шесть для пиковой интенсивности шума. Теперь нажмите «Начать приобретение». Во время съемки при необходимости перефокусируйтесь на клетку.
Отрегулируйте время экспозиции и в конечном итоге включите лазерную линию 405 нанометров, начиная с 0,001%, чтобы сохранить среднюю плотность флуорофоров с минимальным расстоянием в один микрометр между отдельными молекулами. Убедитесь, что пик точности локализации на гистограмме под восстановленным изображением центрирован примерно или ниже 10 нанометров. Нажмите кнопку «стоп», чтобы завершить фильм, когда будет достигнуто более миллиона локализаций.
Сохраняйте необработанные данные из сбора данных STORM в формате CZI. Затем в средстве «Каналы» отметьте дорожку 555, снимите галочку с дорожки 647 и выберите дорожку 555. Далее нажмите кнопку непрерывной работы.
Установите время экспозиции на 30 миллисекунд, а усиление на ноль. Затем установите оба лазера 488 и 561 на 100%, чтобы накачать красители Alexa 555 до темного состояния. Используйте режим подсветки HILO.
Как только флуорофоры исчерпаются, нажмите стоп. Установите коэффициент усиления на 250 и уменьшите значение лазера 488 до 50%Используйте индикатор диапазона, чтобы проверить, что отдельные молекулы не насыщают камеру. Если это так, уменьшите усиление.
Теперь нажмите «Начать приобретение». Во время захвата увеличивайте усиление постепенно, чтобы достичь предела насыщения. Постепенно увеличивайте мощность лазера 405 нанометров, чтобы активировать молекулы и достичь средней плотности в поле зрения.
Уменьшите мощность лазера 488 нм до 30%, когда лазер 405 составляет около 15%Затем постепенно уменьшайте мощность лазера 488, увеличивая мощность лазера 405, чтобы поддерживать мигание молекул как можно быстрее и со средней плотностью. Лазерная линия 488 в сочетании с лазером возбуждения 561 при максимальной интенсивности увеличивает как скорость включения, так и выключения флуорофоров, в то время как лазерная линия 405 только увеличивает скорость включения. Остановите сбор данных, когда будет достигнуто 500 000 или более локализаций или когда молекулы больше не будут мигать.
Затем сохраните необработанные данные из сбора данных STORM в формате CZI. Чтобы выполнить реконструкцию изображения с помощью инструмента PAL-Drift, выберите тип коррекции на основе модели с автоматическими сегментами с максимальным размером восьми. Нажмите «Применить» несколько раз подряд, пока смещение не будет исправлено.
Эта коррекция на основе модели применяет алгоритм, основанный на взаимно-корреляционном анализе, который корректирует дрейф. С помощью инструментов фильтра PAL улучшите внешний вид изображения STORM, выбрав только те молекулы, которые были лучше всего локализованы. Например, ограничьте точность локализации до 30 нанометров, а PSF до 120-180 нанометров.
С помощью инструмента PAL-Render используйте разрешение в пикселях пять или 10 нанометров и параметры в соответствии с текстовым протоколом. Выберите рендеринг автодинамического диапазона HR со значением 95% и рендеринг автодинамического диапазона SWF со значением 90%. Затем выберите наилучшее качество рендеринга.
В меню PALM на вкладке обработки выберите PALM convert. Нажмите кнопку «Выбрать», а затем примените. Наконец, сохраните созданное изображение в формате LSM, а не CZI.
На этом рисунке показан типичный пример изображения D-STORM филаментов виментина, иммуномеченных с помощью Alexa 647. Увеличение разрешения можно ясно заметить при сравнении с изображением, полученным с помощью стандартного широкоугольного микроскопа. Профили интенсивности флуоресценции, представленные на этом графике, показывают, что микроскопия сверхвысокого разрешения позволяет получить разрешение пучков виментина.
Разрешения D-STORM достаточно для подсчета количества нитей, присутствующих в пучках. Здесь показан типичный пример двухцветной визуализации D-STORM виментина и сетей микротрубочек, меченных с помощью Alexa 647 и Alexa 555 соответственно. Хорошие изображения виментина должны иметь не менее 5000 локализаций на квадрат микрометра и 2500 локализаций на квадрат микротрубочек.
После освоения этой техники ее можно выполнить за три дня, если она выполнена правильно. При попытке проведения этой процедуры важно адаптировать методы фиксации и параметризации к белку, который будет визуализироваться. Например, фиксация только глутаральдегидом дает плохие результаты для промежуточных нитей, но лучше всего подходит для фиксации микротрубочек.
Важно помнить, что нужно использовать свежеприготовленные образцы и растворы, особенно MEA, pH которых необходимо тщательно регулировать. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии к изучению морфологии наноскопических клеточных структур. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять подготовку образцов, получение изображений и реконструкцию двухцветных изображений промежуточных нитей и микротрубочек в формате D-STORM.
Не забывайте, что работа с некоторыми растворами, особенно PFA, NABH4, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток, работа под химическим колпаком и использование специальных контейнеров.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данная методика направлена на установку оптимальных экспериментальных условий для двухцветной 2D-визуализации микротрубочек и промежуточных филаментов в фиксированных клетках с помощью dSTORM. Она позволяет улучшить характеристику цитоскелетных сетей, которые зачастую не разрешаются при использовании традиционной флуоресцентной микроскопии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Методы визуализации
Теоретические основы
- Визуализация методом D-STORM обеспечивает высокое разрешение при отображении клеточных структур.
- Микротрубочки и промежуточные филаменты являются критически важными компонентами цитоскелета.
- Обычная флуоресцентная микроскопия может быть недостаточной для разрешения сложных взаимодействий в этих сетях.
- Подготовка образцов и сбор данных имеют решающее значение для минимизации артефактов.
Цель исследования
- Оптимизировать условия для визуализации микротрубочек и промежуточных филаментов.
- Углубить понимание взаимодействий элементов цитоскелета.
- Представить визуальную демонстрацию методологии.
Используемые методы
- Подготовка клеток U373 в соответствии с установленным протоколом.
- Промывка клеток PBS перед фиксацией.
- Использование предварительно нагретого экстракционного фиксирующего раствора для фиксации клеток.
- Получение изображений dSTORM для анализа структур цитоскелета.
Основные результаты
- Успешная визуализация микротрубочек и промежуточных филаментов.
- Повышенное разрешение клеточных структур по сравнению с традиционными методами.
- Продемонстрированный контроль над подготовкой образцов и сбором данных.
- Характеристика взаимодействий внутри цитоскелетных сетей.
Выводы
- Данная методология представляет собой надежный подход к изучению динамики цитоскелета.
- В работе подчеркивается важность тщательной подготовки образцов.
- Будущие области применения могут включать исследование других клеточных структур.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Разрешение плотных цитоскелетных сетей, таких как промежуточные филаменты и микротрубочки, имеет решающее значение для понимания скоординированных клеточных функций в моделях заболеваний. Двухцветная визуализация методом dSTORM обеспечивает наноразмерное разрешение для визуализации физических связей между этими сетями, что позволяет механистически снизить риски при работе с мишенями, участвующими в регуляции цитоскелета. Эта возможность поддерживает валидацию мишеней и разработку анализов, выявляя структурные зависимости, которые влияют на клеточную подвижность, полярность и внутриклеточный транспорт — ключевые фенотипы в исследованиях нейродегенеративных и онкологических заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации прямых ассоциаций между промежуточными филаментами и микротрубочками с разрешением <10 nm.
- Практическая ценность: обеспечивает количественную оценку пучкования филаментов и плотности сети для подтверждения функциональной значимости мишени.
- Прогностическая ценность: проясняет механистические связи между компонентами цитоскелета, снижая неопределенность при интерпретации путей во время выбора мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать стандартизированные данные визуализации высокого разрешения, пригодные для бенчмаркинга анализов при скрининге модуляторов цитоскелета.
- Практическая ценность: устанавливает воспроизводимые протоколы сбора и реконструкции данных двухцветной dSTORM-микроскопии, обеспечивая согласованность результатов между различными лабораториями.
- Масштабируемость: поддерживает повторное использование платформы для различных клеточных линий и белковых мишеней при адаптации условий фиксации и мечения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает наноразмерную организацию цитоскелета с клеточными фенотипами, имеющими значение для моделей заболеваний, такими как активация глиальных клеток или целостность нейронов.
- Механистическое снижение рисков: разъясняет, как промежуточные филаменты виментина служат шаблоном и стабилизируют организацию микротрубочек, что позволяет создавать прогностические модели дефектов везикулярного транспорта.
- Релевантность доклинической модели: используются глиальные клетки U373 — система, имеющая значение для изучения нейровоспаления и прогрессирования глиомы.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез о мишенях до идентификации ведущих соединений, где целостность цитоскелета служит фенотипическим показателем воздействия соединений на структуру и функцию клеток.
- Поисковая биология: способствует проверке гипотез, позволяя определить, нарушают или стабилизируют соединения совместную организацию промежуточных филаментов и микротрубочек.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет количественных показателей, таких как плотность локализации (>5,000/µm² для виментина, >2,500/µm² для микротрубочек) и разрешение пучков.
- Аналитика: обеспечивает высокоточные измерения расстояния между филаментами и их колокализации, что позволяет сравнивать структурные фенотипы при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывают наноразмерную визуализацию с микротрубочкозависимыми процессами, такими как везикулярный транспорт, что актуально для разработки нейротерапевтических средств.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного применения метода визуализации сверхвысокого разрешения для изучения любой пары белков цитоскелета при условии их маркировки совместимыми флуорофорами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет разрешения наноразмерных взаимодействий цитоскелета, невидимых при использовании традиционной микроскопии.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию за счет фиксированных параметров сбора данных (например, лазер 642 nm с мощностью 0,2% для активации и 100% для истощения) и порогов реконструкции (точность локализации <10 nm).
- Стратегическая ценность: Снижает биологические риски на поздних этапах за счет возможности раннего обнаружения дисрегуляции цитоскелета в доклинических моделях.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения по продвижению проектов с учетом рисков, предоставляя структурные доказательства взаимодействия мишени в путях цитоскелета.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микроскопией сверхвысокого разрешения, иммуноокрашиванием и оптической юстировкой TIRF/HILO.
- Зависит от наличия специализированного оборудования, включая объектив 100x NA 1.46, линзу Optivar и лазерные линии с длиной волны 405, 488, 561 и 642 nm.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов фиксации (например, концентрации PFA, гашения боргидридом натрия) для минимизации автофлуоресценции и сохранения целостности эпитопов.
- Требуется адаптация плотности мечения и мощности лазера при работе с различными белками, что подтверждается различиями в настройках для Alexa 647 и Alexa 555.
- Ограничено необходимостью использования свежеприготовленных растворов и строгого контроля условий окружающей среды для предотвращения дрейфа и обеспечения характерного мерцания одиночных молекул.
