Флоэма Sap выборки из Brassica napus для 3D-страница белков и рибонуклеопротеида комплексов

Общая цель этой процедуры 3D-PAGE заключается в выделении белковых и рибонуклеопротеиновых комплексов из сока Brassica napus ploem в сочетании с идентификацией соответствующих нуклеиновых кислот и белковых компонентов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биохимии и физиологии растений. Например, можно проанализировать состав комплексов флоэм под нагрузкой.

Основное преимущество методики заключается в том, что можно собирать чистый сок флоэмы и одновременно анализировать нуклеиновые кислоты, а также белковые компоненты. Хотя этот метод может дать представление о взаимодействии белковых белков и белковых нуклеиновых кислот в системе флоэм масличного рапса, он также может быть применен для анализа флоэм других растений, таких как тыквы, люпины и юкка. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы попытались определить партнеров по взаимодействию белка и РНК для конкретного белка флоэмы.

Сначала несколько раз проколите соцветие восьминедельного растения B.napus с помощью иглы для подкожных инъекций диаметром 0,8 миллиметра. Проколите несколько других соцветий на том же растении и других растениях, чтобы получить достаточное количество сока флоэмы. Сотрите первую каплю с каждого травмированного участка фильтровальной бумагой.

После удаления первых капель с помощью пипетки соберите оставшиеся капли. И переложите их в предварительно охлажденную коническую реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем храните собранный экссудат при температуре минус 20 градусов по Цельсию с помощью системы охлаждения без ото льда.

Продолжайте собирать капли до тех пор, пока не будет наблюдаться дальнейшее образование капель, но не дольше одного часа. Далее добавьте образец флоэмы в центробежный концентратор с отсеченной молекулярной массой 10 000 дальтон и сконцентрируйте примерно до 1/6 от первоначального объема. Затем центрифугируйте концентрированный образец при четырех градусах Цельсия и 20 000 г в течение не менее 15 минут, чтобы удалить частицы пыли.

Чтобы выполнить синий нативный PAGE, соберите гелевую камеру. И добавляем темно-синий катодный буфер B к половине, и промойте лунки катодным буфером. Загрузите от 20 до 30 мкг концентрированного белка из каждой лунки в коммерческий лучистый гель Bis-Tris не менее чем в три раза.

Заполните камеру катодом и анодным буфером и запустите гель при четырех градусах Цельсия и 150 вольтах, пока образец не пройдет 1/3 геля, что займет от 20 до 30 минут. Ставим на паузу прогон замены темно-синего катодного буфера B со светло-голубым катодным буфером B 1/10. Возобновите прогон и продолжайте до тех пор, пока синий фронт не начнет вымываться из геля, что занимает от 120 до 180 минут.

Вырежьте из родного синего геля целую гелевую дорожку, затем перенесите на нейлоновую мембрану методом полусухого промокания, а верхнюю и нижнюю границы геля отметьте на мембране карандашом. После промокания промойте мембрану водой, обработанной DEPC, и поместите между собой два листа фильтровальной бумаги для просушки. После этого выполните УФ-сшивание промокаемой мембраны с прикладываемой энергией 120 000 микроджоулей на квадратный сантиметр.

Теперь предварительно гибридизируйте УФ-сшитую мембрану с шестью миллилитрами буфера для гибридизации в течение 60 минут при температуре 68 градусов Цельсия в гибридизационной печи. Добавьте к мембране дополнительно один миллилитр гибридизационного буфера, содержащего четыре микролитра 3-прайм-биотинилированных зондов. Затем инкубируйте мембрану с зондом в течение ночи, охлаждая печь для гибридизации с 68 до 37 градусов Цельсия.

На следующий день промойте мембрану буфером, содержащим 2x SSC и 0,1% SDS, в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы удалить зонды, связанные неспецифически. Выполнить детектирование 3-прайм биотинилированных зондов на мембране с конъюгатом стрептавидина HRP и люминолом в качестве субстрата пероксидазы хрена, в результате чего возникает чувствительная хемилюминесцентная реакция. Вырезают одинарные ленты из синего нативного геля.

Полосы комбайна из образцов проложите параллельными полосами в конической реакционной пробирке объемом 1,5 миллилитра для достижения дополнительной концентрации сложных белков. Чтобы приготовить 12%-ный гель мочевины Tris-Tricine, налейте 10 миллилитров раствора геля А между двумя стеклянными пластинами и обложите изопропанолом. После полимеризации удалите изопропанол, добавьте в гель два-три миллилитра гелевого раствора В, и вставьте 10 лунок гребня.

Для уравновешивания вырезанных кусочков геля добавьте в реакционную пробирку один миллилитр 2x буфера для образцов SDS. После инкубации образца в течение 10 минут при комнатной температуре нагрейте его в нагревательном блоке при температуре 95 градусов Цельсия в течение примерно одной минуты. Затем инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 15 минут.

После этого сложите несколько уравновешенных кусочков геля, представляющих один и тот же комплекс, в один единый карман для геля. После сборки гелевой камеры проведите электрофорез с использованием анодных и катодных рабочих буферов при напряжении 150 вольт в течение 45-60 минут. Когда закончите, вырежьте всю гелевую дорожку.

Инкубируйте срезанную гелевую дорожку в течение 20 минут в кислом буфере. Затем уравновесьте в 125 миллимолярах Tris-HCL при pH 6,8 в течение еще 20 минут. Налейте 15% раствор разделяющего геля SDS в соответствии с полосой.

Как только гель застынет, удалите изопропанол, добавьте три миллилитра 4%-ного стекирующего раствора геля и вставьте специальную расческу для гелей IPG. После затвердевания перенесите уравновешенную гелевую дорожку на гель SDS и покройте гель 0,5% агарозой в 1x SDS беговом буфере с добавлением следов бромфенольного синего. После сборки гелевой камеры запустите гель при напряжении 150 вольт в течение 60 минут.

По окончании окрашивайте гель коллоидным раствором Кумаси для последующего масс-спектрометрического анализа. Наконец, проанализируйте видимые белковые пятна с помощью матричной лазерной десорбции и ионизационной времяпролетной спектрометрии. Здесь изображен репрезентативный результат, полученный из чистого образца флоэмы.

Незагрязненные образцы флоэмы демонстрируют видимую полосу тиоредоксинового возраста, в то время как сигнала для RuBisCO и белка пыльцевой оболочки не наблюдается. По крайней мере, четыре основные полосы белкового комплекса становятся видимыми после BN PAGE сока B.napus phloem. Слишком низкие или слишком высокие концентрации сока флоэмы не позволяют провести четкое разделение комплексов.

Разделение с высоким разрешением наблюдается в 3D PAGE из-за различного поведения миграции белков в гелях мочевины и SDS-PAGE. Как правило, белки, принадлежащие к одному комплексу, будут видны в виде диагональной линии, проходящей через гель. Белки выше этой линии имеют повышенную гидрофобность, в то время как белки ниже этой линии более гидрофильны.

BN northern blotting показывает, что специфическая тРНК присутствует только в одном конкретном комплексе. Масс-спектрометрический анализ показал, что этот комплекс содержит в основном тРНК-лигазы, что подтверждает активность связывания тРНК, обнаруженную при северном блоттинге BN. После освоения этой техники ее можно сделать за три дня, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно не забыть надеть перчатки и лабораторный халат, чтобы свести к минимуму загрязнение каротином, которое будет препятствовать масс-спектрометрическому анализу. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как зимограммы и ферментные анализы с собранным соком флоэмы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как исследования сложной активности и ингибирования. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области растениеводства к исследованию многосубъединичных комплексов в образцах флоэм различных видов растений.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять сок флоэмы из растений Brassica napus, а также как выделять и анализировать белковые белковые и белковые нуклеиновые кислотные комплексы. Не забывайте, что работа с SDS, акриламидом и TMET может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа под капотом в перчатках и лабораторном халате.