Полнопольная оптическая когерентная микроскопия для гистологического анализа стромальных особенностей роговичных трансплантатов

Этот метод позволяет улучшить скрининг и отбор донорских тканей роговицы в глазных банках, улучшить результаты трансплантации роговицы. Основным преимуществом этого метода является возможность оценки с высоким разрешением и то, что роговица остается погруженной в закрытую камеру, заполненную носителем информации на протяжении всего получения изображения, что снижает любой потенциальный риск загрязнения. Продемонстрирует процедуру Маэль Вильберт, выпускница аспирантуры нашей лаборатории.

Для начала поместите роговицу, погруженную в носитель для хранения, в держатель образца эпителием вверх. Поместите чистый кварцевый покров, прилагаемый к держателю образца, поверх роговицы. Затем закройте держатель, осторожно поворачивая его основание, пока образец не станет слегка сплющенным и не будет иммобилизован под покровным стеклом, обеспечивая относительно ровную поверхность изображения.

Примите меры предосторожности, чтобы избежать пузырьков воздуха. Нанесите толстый слой офтальмологического или оптического геля на покровное стекло в качестве иммерсионной среды. Инициализируйте устройство, включив выключатель питания на задней панели устройства.

Загорание зеленого светодиода на передней панели устройства указывает на то, что питание включено. Убедитесь, что сцена визуализации свободна, за исключением подвижного лотка. Затем нажмите OK в программном обеспечении для сбора данных, чтобы инициализировать двигатели в командной строке.

Чтобы настроить устройство, введите образец идентификатора в специальное и обязательное поле. И, при желании, введите образец описания и описание исследования. Затем нажмите кнопку Получить макроизображение, чтобы создать моментальный снимок образца, который впоследствии можно использовать для бокового позиционирования и навигации.

Когда все будет удовлетворено, проверьте изображение в командной строке, нажав кнопку «Да». После чего устройство переместит лоток для образцов под объектив и выполнит автоматическую настройку. Прежде чем продолжить, убедитесь, что объектив микроскопа хорошо погружен в оптический гель.

Подготовьте приобретение, перейдя на вкладку «Обзор». Перед получением стопки изображений перейдите к центру роговицы с помощью джойстика или ручного выбора на экране. Изменяйте глубину изображения с помощью вращения джойстика, регулировки ползунка или ручного ввода с клавиатуры в графическом интерфейсе пользователя.

Затем отрегулируйте значение усреднения до 40 для оптимальной визуализации роговицы. Введите значение поверхности роговицы или местоположение первого изображения в поле глубины. Затем выберите вкладку «Получить», чтобы получить изображения.

Выберите и установите интервал между срезами, соответствующий осевому разрешению устройства. Введите значение толщины роговицы в поле «Количество срезов». Проверьте параметры и время получения.

И когда вы будете удовлетворены, нажмите OK, чтобы начать приобретение. Во время сбора избегайте контакта со столом, на котором расположен микроскоп. Чтобы оценить толщину стромального слоя и слоя Боумена, измерьте расстояния поперечных сечений роговицы.

Например, добавьте пять точек на равном расстоянии друг от друга в поперечном сечении, как описано в текстовой рукописи. Проведите линию между двумя точками известного расстояния в соответствии с полем зрения по умолчанию. Затем перейдите на вкладку «Анализ» и выберите «Установить масштаб».

Введите известное расстояние и единицу длины в соответствующие поля. Установите значение 1024 пикселя или 780 микрометров и нажмите кнопку ОК. Проведите линию между двумя точками с неизвестным расстоянием и считайте длину или расстояние, измеренное непосредственно из строки состояния. Запишите среднее значение и коэффициент вариации.

Перейдите на вкладку «Изображение» и выберите «Срез Z» в разделе «Стеки», чтобы определить плотность кератиноцитов. Это суммирует стромальные изображения лица в группах по семь штук, чтобы получить срезы сопоставимой толщины. Для дальнейшего анализа включите все доступные срезы для передней стромы, 15 изображений для передней стромы, пять изображений для средней стромы и пять изображений для задней стромы.

На каждом изображении выберите интересующую область размером 300 на 300 микрометров. Чтобы улучшить визуализацию ядра, инвертируйте изображение с помощью кнопки «Инвертировать» на вкладке «Правка». Отрегулируйте контрастность и яркость, щелкнув вкладку «Изображение» и перейдя в раздел «Яркость-контрастность».

Чтобы вручную подсчитать ядра ячеек, перейдите в раздел «Подключаемые модули» и перейдите в раздел «Счетчик ячеек» на вкладке «Анализ». Нажмите кнопку Инициализировать и выберите тип счетчика. Затем подсчитайте ядра клеток, нажимая на темные овальные элементы на перевернутом изображении, рассматривая те, которые приземляются на границу изображения только для двух из четырех сторон изображения.

Выбранная донорская роговица человека была опухшей после хранения в питательной среде органов, что давало патофизиологическую модель отечной роговицы и препятствовало получению изображения по всей толщине роговицы из-за ограниченной глубины проникновения. Переход на декстрин дополнял питательную среду органа, уменьшал отек и приводил к донорской роговице нормальной толщины. Больные роговицы распознавались по морфологическим изменениям и типичным стромальным особенностям, включая уменьшение переменной толщины стромы или слоя Боумена.

Оценка плотности кератиноцитов и стромальной отражательной способности также способствовала гистологическому анализу и дифференциации нормальных и патологических тканей роговицы с помощью полнопольной оптической когерентной микроскопии, что выходит за рамки возможностей систем клинической оптической когерентной томографии. Посмотрев это видео, вы должны хорошо понимать, как выполнять качественный и количественный гистологический анализ стромы роговицы, позволяющий дифференцировать заболевание от нормальных тканей роговицы человека.