Пройдя через сигнализации различных белковых комплексов, очищение сродства Bimolecular дополнения (BiCAP)

Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы клеточной биологии и биохимии, такие как как динамическая сборка белка и белковых комплексов контролирует сигнальные пути и поведение клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем специфически изолировать два взаимодействующих белка, исключая при этом несложные отдельные белки и конкурирующих партнеров по связыванию. Хотя мы используем этот метод для получения информации о рецептивной димеризации тирозинкиназы при раке молочной железы, он также может быть применен к любым другим физиологическим условиям или заболеваниям.

Впервые у нас появилась идея для этого метода, когда мы поняли, что нанотело GFP распознает трехмерный эпитоп GFP и других флуоресцентных белков. Для начала добавьте 150 нанограмм вектора входа, 150 нанограмм вектора назначения и восемь микролитров буфера TE в пробирку объемом 0,2 миллилитра. Затем добавьте два микролитра рекомбиназы и ZiMex, и быстро центрифугируете.

Инкубируйте реакцию в течение одного часа при комнатной температуре, затем добавьте один микролитр раствора протеиназы К и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы остановить реакцию. Затем разморозьте клетки, способные к тепловому шоку, на льду. И перенесите 50 микролитров ячеек в 14-миллилитровую полипропиленовую трубку с круглым дном.

Добавьте в клетки один микролитр продукта реакции, и аккуратно перемешайте. Инкубируйте клетки в течение 20 минут на льду. Затем подвергните клетки тепловому удару на водяной бане при температуре 42 градуса Цельсия в течение 45 секунд, прежде чем вернуть клетки на лед.

Добавьте в ячейки один миллилитр LB среды. И инкубируйте образец с встряхиванием в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию. Затем поместите трансформацию на 10-сантиметровую агаровую пластину с ампициллином и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

Чтобы начать очистку плазмид, добавьте ампициллин и 100 миллилитров ЛБ-среды в большую коническую колбу. Затем используйте петлю инокуляции, чтобы удалить одну колонию из агаровой пластины. Погрузите петлю инокуляции в среду LB и кратко перемешайте, затем накройте верхнюю часть колбы алюминиевой фольгой и инкубируйте ее в течение ночи, при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием.

Отсюда очистите плазмидную ДНК с помощью стандартного набора для очистки плазмидной ДНК Maxiprep, прежде чем приступить к трансфекции. Сначала посейте клетки HEK 293T в 10-сантиметровые посуды, содержащие 10 миллилитров DMEM. Затем разведите по 2,5 мкг каждого вектора комплементации бимолекулярной флуоресценции в 500 микролитрах трансфекционного буфера.

Добавьте 10 микролитров реагента для трансфекции, и перемешайте смесь в течение 10 секунд. Затем на короткое время центрифугируют образцы, и инкубируют их при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавьте смесь для трансфекции ДНК по каплям в блюдо.

Затем инкубируйте образцы в течение восьми-24 часов. Подготовьте буфер для лизиса клеток и буфер для лизиса клеток с добавками, как указано в текстовом протоколе. Затем дважды промойте клетки ледяным ПБС.

Аспирируйте PBS и добавьте один миллиметр буфера для лизиса клеток, дополненного ледяным холодом. Далее поставьте блюдо на лед и выдерживайте в течение пяти минут. Затем с помощью скребка для клеток удалите клетки и перенесите их в охлажденную микроцентрифужную пробирку.

Центрифугируйте пробирку при давлении 18 000 градусов тяжести в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор, затем перенесите прозрачную надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку. Промойте соответствующий объем агарозных шариков в одном миллилитре PBS, затем центрифугируйте шарики при 300-кратном давлении и осторожно удалите надосадочную жидкость. Далее добавьте в каждый образец по 20 микролитров агарозных шариков.

И инкубировать при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух часов, с вращением из конца в конец. Центрифугируйте шарики при 300-кратном давлении и промойте их в буфере для лизиса клеток три раза. Затем повторно суспендируйте промытые шарики в 50 микролитрах разбавленного образца буфера.

Наконец, нагрейте образцы до 95 градусов Цельсия в течение двух-трех минут. В данном исследовании метод BiCAP используется для наблюдения положительного взаимодействия нескольких типов белков примерно через 16 часов после котрансфекции HEK293T клеток. Конфокальная микроскопия используется для наблюдения за димеризацией RTKERBB2 на плазматической мембране и связыванием убиквитина с Е3-лигазой UBR5.

После аффинной очистки с помощью нанотела GFB в образце совместной трансфекции может быть обнаружен только полноразмерный контрольный белок Venus и взаимодействующие белки, меченные V1 и V2. Пытаясь выполнить эту процедуру, не забывайте оптимизировать размещение бимолекулярной флуоресцентной метки комплементации и либо С-концевого, либо N-концевого конца интересующего вас белка. Это необходимо для того, чтобы наблюдать положительное взаимодействие белок/белок.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять технику BiCAP и как применять ее к интересующему вас белковому взаимодействию. Следуя этой процедуре, можно использовать многие методы определения характеристик, такие как ChIPseek, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как димеризация факторов транскрипции контролирует связывание ДНК.