Двухэтапный подход к исследовать ранние - и поздно этапы формирования органа в модели птичьего: тимуса и паращитовидных желез органогенеза парадигмы

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить двухэтапный подход к изучению ранних и поздних стадий органогенеза путем сочетания манипуляций с эмбриональными тканями in vitro с методами трансплантации in ovo с использованием птичьей модели. В этом способе эмбриональная территория, содержащая потенциальный зачаток органа, изолируют и выращивают в органотипической системе в течение 48 часов. Имитируя нормальное развитие, этот подход in vitro обеспечивает легкий доступ к эмбриональным территориям без необходимости использования специфических молекулярных маркеров и позволяет проводить экспериментальные манипуляции на ранних стадиях развития в формировании органов, которые основаны на высокодинамичных пространственных модификациях и сложных тканевых взаимодействиях.

Затем культивируемые ткани пересаживают на хориоаллантоисную мембрану куриного эмбриона. Хориоаллантоисная мембрана действует как сосудистый поставщик питательных веществ и обеспечивает газообмен к трансплантированным тканям, способствуя его развитию в яйце. Этот этап особенно хорошо подходит для изучения поздних стадий органогенеза, так как полностью сформированные органы могут быть достигнуты уже через 10 дней развития яйцеклетки.

Кроме того, фармакологические средства могут быть введены in vitro и in ovo, что позволяет модулировать сигнальные пути в зависимости от стадии развития. В конечном счете, развивающиеся ткани могут быть собраны в любое временное окно для оценки прогрессии органогенеза и анализа экспрессии генов и морфологических особенностей. Отслеживая процесс формирования органов вне птичьего эмбриона, этот метод может помочь пролить свет на ключевые вопросы биологии развития, такие как идентификация сигналов, участвующих в отдельных этапах формирования органов.

Эта экспериментальная процедура будет проиллюстрирована изучением органогенеза тимуса и паращитовидных желез. У птиц эпителии этих органов происходят от эндодермального общего зачатка третьего и четвертого глоточных мешочков и проявляются в виде дискретных доменов примерно на четвертый день эмбрионального периода у перепелов и на четвертый/пятый день у куриц. По мере развития зачатки органа индивидуализируются и отделяются от глотки.

На более поздних этапах развития эпителий тимуса колонизируется кроветворными прогениторными клетками. Представленный здесь метод начинается с выделения эмбриональной территории перепела, содержащей предполагаемую территорию этих органов, то есть глоточную область, содержащую третью и четвертую дуги, на третий день эмбрионального периода. Оплодотворенные перепелиные яйца инкубировали в воздушной камере вверх в течение трех дней при температуре 38 градусов по Цельсию в увлажненном инкубаторе.

Для начала достаньте перепелиные яйца из инкубатора. Проводите процедуры манипуляций с яйцеклетками в стерильных условиях с использованием горизонтального ламинарного проточного колпака и стерилизованных инструментов и материалов. Приготовьте большую миску Pyrex, наполненную холодным PBS.

Изогнутыми ножницами откройте перепелиное яйцо, постучав по скорлупе и вырезав круглое отверстие в противоположной стороне воздушной камеры. Аккуратно высыпаем зародыш в блюдо. Держите эмбрион в тонких щипцах и с помощью изогнутых ножниц сделайте надрез в вителлиновой мембране, окружающей гнеток.

Разрежьте вокруг и наружу по окружности дополнительные эмбриональные сосуды непрерывным движением. Переложите зародыш в небольшую миску с холодной PBS. Затем с помощью шумовки перенесите эмбрион в чашку Pyrex Petri с черной основой, содержащей холодный PBS.

Под стереомикроскопом приложите эмбрион к нижней части пластины с помощью тонких булавок от насекомых. Поместите четыре булавки, образующие квадратную форму, в дополнительную эмбриональную область. С помощью щипцов удаляют лишние эмбриональные оболочки головной области и ставят туда пятый штифт.

Теперь эмбрион расположен правильно и видны глазной пузырь, сердечная трубка, а также первая, вторая и третья дуги глотки. Начните рассекать интересующую область, то есть третью и четвертую области глоточной дуги, с помощью глазных ножниц Wecker. Сделайте разрез продольно и параллельно оси зародыша между областью сомитов и нервной трубки и дугами глотки.

Затем удалите вентрально расположенную сердечную трубку, разрезав ее. Удерживайте ножницы в одном и том же положении, вращайте чашку Петри, чтобы переместить эмбрион в соответствии с направлением разреза. В конце разрезаем между второй и третьей глоточными дугами и ниже четвертой глоточной дуги.

Отоберите выделенные ткани и перенесите их в стеклянную чашку, наполненную холодной PBS, с помощью стерильной пластиковой пипетки. Держите его на льду во время подготовки анализа in vitro. Заполните одну лунку из шестилуночного планшета 5 мл питательной среды и поместите на лунку вставку из поликарбонатной мембраны.

Под стереомикроскоп перенесите эксплант путем мягкого скольжения с помощью шпателя и щипцов со стеклянной чашки на поверхность мембраны. В качестве альтернативы экспланты можно культивировать в плавающих мембранных фильтрах. Для этой процедуры приготовьте 35-миллиметровую чашку Петри с 5 мл питательной среды.

Используйте щипцы для плавания мембранного фильтра, удерживая сухую поверхность в контакте с воздухом. Как и прежде, переложите эксплант из стеклянной посуды на поверхность мембраны с помощью осторожного скольжения. Экспланты должны быть размещены вентральной стороной вверх, а дорсальная сторона должна соприкасаться с мембраной.

Добавьте до восьми эксплантов на мембранный фильтр. Осторожно поместите шестилуночную пластину и чашку Петри с эксплантами во увлажненный инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию с пятью процентами углекислого газа. После 48-часового инкубационного периода достаньте тарелку и чашку Петри из инкубатора.

Для сбора культивируемых эксплантов из шестилуночного планшета в мембранную вставку добавляют PBS комнатной температуры. Отделите культивированные экспланты от мембраны путем энергичной промывки с помощью стерильной пластиковой пипетки. С помощью шпателя и щипцов переложите культивированные экспланты в стеклянную посуду, наполненную PBS комнатной температуры.

Аналогичным образом соберите культивируемые экспланты из плавающего мембранного фильтра. В этом случае переносят мембранный фильтр с щипцами в новую чашку Петри, заполненную PBS при комнатной температуре. Отсоедините экспланты от мембранного фильтра с помощью энергичного пипетирования.

Разрядите мембранный фильтр, не содержащий эксплантов, убедившись, что к нему не осталось прикрепленных эксплантов. С помощью шпателя и щипцов осторожно перенесите экспланты в 1 мл реагента для выделения общей РНК для проведения исследований экспрессии генов. Культивируемые экспланты также могут быть выращены в ово для конкуренции с формированием органов.

Сначала подготавливают хориоаллантоисную мембрану. Для этого извлеките из инкубатора куриные яйца с восьмидневного развития. Яйца инкубировали воздушной камерой вверх в увлажненном инкубаторе при температуре 38 градусов по Цельсию.

Накройте тупой конец яйца прозрачной пластиковой лентой, чтобы кусочки скорлупы не попали в воздушную камеру. Постучите по скорлупе и изогнутыми ножницами вырежьте в яйце круглое отверстие. Воздушная камера должна стать видимой.

Медленно снимите белую мембрану воздушной камеры с помощью щипцов. Хориоаллантоисная мембрана становится видимой и доступной для трансплантации эктопической ткани. Не используйте PBS для гидратации до хориоаллантоисной мембраны до или после трансплантации, так как PBS способствует скольжению и неправильному размещению эксплантов.

Начните с выполнения небольших сосудистых поражений в более мелких сосудах мембраны. Для этой процедуры используют микроскальпель в держателе. В случае чрезмерного кровотечения из раны удалите кровь капиллярами с помощью наконечника пипетки Пастера.

Перенесите эксплант на раненый участок мембраны с помощью шпателя и щипцов. Отрежьте кусок фильтровальной бумаги с чуть большим размером, чем эксплант, и положите его поверх экспланта. Фильтровальная бумага помогает отслеживать место экспланта после его развития в хориоаллантоисной мембране.

При необходимости фильтровальная бумага также позволяет ежедневно доставлять лекарство экспланту во время развития яйцеклетки. Заклейте окошко для яиц прозрачной пластиковой лентой и определите его с помощью угольного карандаша. Пластиковая лента защищает эмбрион от обезвоживания в период инкубации.

Инкубируйте обработанное яйцо во влажном инкубаторе при температуре 38 градусов по Цельсию. После 10 дней инкубации соберите яйцо и аккуратно извлеките пластиковую ленту. Разрежьте хориоаллантоисную мембрану вокруг области фильтрации с помощью изогнутых ножниц и перенесите эксплант с фильтровальной бумагой в небольшую миску Pyrex, наполненную холодным PBS.

С помощью щипцов переложите эксплант в 100-миллиметровую посуду с черным основанием, заполненным PBS. Аккуратно удалите фильтровальную бумагу и излишки мембраны с помощью глазных ножниц и щипцов Wecker. С помощью скиммера переведите трансплантаты в фиксирующий раствор и оцените органообразование в парафиновых срезах методом обычной гистологии, иммуногистохимии.

Здесь изображен экспериментальный план, используемый для изучения ранних стадий формирования тимуса и паращитовидных желез. В качестве примера можно привести оценку экспрессии генов, о которых известно, что они участвуют в развитии области дуги глотки, во время нормального развития с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Транскрипты трех генов Tbx1, Six1 и Bmp4 были обнаружены в свежевыделенных тканях и после 48 часов культивирования.

Для изучения роли сигнальных путей Notch и Hedgehog в культуральную среду в процессе развития in vitro в культуральную среду добавляли фармакологические ингибиторы. Уровни экспрессии трех генов были значительно снижены в третьей и четвертой областях дуги глотки, выращенных в течение 48 часов в присутствии ингибитора Notch, по сравнению с контролируемыми условиями. И наоборот, только транскрипты Bmp4 были значительно снижены в культивируемых тканях, когда передача сигналов Hedgehog была заблокирована.

Для изучения поздних стадий органогенеза тимуса и паращитовидных желез культивируемые ткани пересаживали на хориоаллантоисную мембрану и давали им удвоиться еще на десять дней. Морфологический анализ органов проводили методами традиционной гистологии и иммуногистохимии. Некоторые репрезентативные результаты следующие:Трансплантаты показали полностью сформированный химерный тимус с QCPN-положительными, перепелиными клетками эпителия тимуса и лимфоидными клетками куриного донорского происхождения.

Кроме того, эпителий тимуса и паратифа показал нормальные морфологические признаки после обнаружения цитокератина. Эпителий тимуса имел ретикулярную архитектуру, в то время как паратиреоидные паренхиматозные клетки имели шаровидную форму, расположены в кластерах и окружены многочисленными капиллярами. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать двухэтапный подход к развитию in vitro и in ovo с использованием модели птиц для исследования роли сигнальных путей, участвующих в различных этапах формирования органов.