Изоляции и культуры грызунов микроглии для поощрения динамичного разветвленная словотолкование в среде Serum-free

Общая цель этого протокола культивирования клеток заключается в получении высокочистых культур микроглии от развивающихся или взрослых грызунов, которые можно поддерживать без контакта с сывороткой. Эта процедура может помочь ответить на ключевые вопросы неврологии, связанные с морфологией микроглии, фиброзным кетозом и взаимодействием микроглии с другими типами клеток ЦНС. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что микроглия может быть быстро выделена из тканей грызунов любого возраста и культивирована без воздействия сыворотки.

Чтобы удалить головной мозг, разрежьте затылочный мыщелок из спинного мозга животного с обеих сторон ножницами для вскрытия, стараясь не повредить мозг. Затем разрежьте кожу вдоль верхней части черепа и разрежьте одну сторону вдоль теменной и лобной кости по направлению к носовой кости. Осторожно оттяните верхнюю часть черепа с помощью щипцов, быстро извлеките мозг и поместите его в предварительно охлажденный DPBS на льду.

Повторите процедуру для всех оставшихся животных. После того, как мозги были собраны в холодном DPBS, измельчите каждый мозг на один кубический миллиметровый кусок в чашке Петри на льду холодным лезвием скальпеля и переложите в ледяной гомогенизатор с пятью-семью миллилитрами ледяного буфера. Затем используйте гомогенизатор свободного подгона, чтобы диссоциировать ткань с помощью 10-20 легких и неполных движений.

Будьте осторожны, чтобы не раздавить непосредственно ткань на дне гомогенизатора. Вместо этого протолкните ткань через пространство между боковыми сторонами поршня и гомогенизатора. Важно медленно гомогенизировать ткань с помощью нескольких раундов облучения, чтобы сохранить жизнеспособность микроглии.

После этого осторожно снимите поршень, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха. Дайте плохо диссоциированным кусочкам ткани осесть на дно гомогенизатора и перенесите надосадочную жидкость в новую, охлажденную, 50-миллилитровую коническую трубку. Затем замените удаленный объем свежим буфером для опьянения и повторите процедуру диссоциации в общей сложности три-четыре раунда или до тех пор, пока вся ткань не будет диссоциирована.

В этой процедуре добавьте ледяной буфер в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую клеточную суспензию, и отрегулируйте общий объем до 33,5 миллилитров. Далее добавьте в клеточную суспензию 10 миллилитров MSB и тщательно перемешайте, несколько раз перевернув пробирку. В результате конечная концентрация MSB составит 23% в объеме 43,5 миллилитров.

После этого центрифугируйте ячейки в течение 15 минут при 500 х g при 4 градусах Цельсия с медленным торможением. Затем удалите верхний слой миелина и мусора, а также надосадочную жидкость с помощью пипетки. Будьте осторожны при снятии верхнего слоя, чтобы убедиться, что он удален как можно больше.

После этого повторно суспендируйте клеточную гранулу в 12 миллилитрах проволочного буфера. Аккуратно растирайте клеточную суспензию, чтобы разбить оставшиеся скопления клеток. На этом этапе пропустите клеточную суспензию через клеточный фильтр с магнитной плотностью 70 микрометров, чтобы удалить крупный мусор или клеточные комки.

Трижды промойте покрытую покрытием форму OX42 с помощью DPBS. Не допускайте полного высыхания пластины между стирками. Слейте с себя последнюю промывку DPBS и нанесите отфильтрованную клеточную суспензию на форму для заготовок.

Аккуратно покрутите пластину, чтобы распределить ячейки. Затем инкубируйте планшет на плоской поверхности при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы клетки прилипли. Не инкубируйте дольше 20 минут, иначе клетки станет очень трудно восстановить из чашки.

После этого промойте форму с помощью DPBS 10 раз, чтобы удалить неадгезивные клетки. Микроглия будет прочно прикреплена к пластине, поэтому поворачивайте пластину при каждом полоскании, чтобы обеспечить удаление других неадгезивных клеток. Слейте последний ДПБС смываем и замените на 15 миллилитров ДПБС и 200 микролитров трипсина.

Чтобы трипсинизировать клетки, инкубируйте чашку менее или равную 10 минутам при температуре 37 градусов Цельсия. После 10 минут трипсинизации микроглия все еще будет прилипать к пластине. Слейте смесь и аккуратно промойте пластину два раза с помощью DPBS, чтобы удалить трипсин.

Затем замените на 12 миллилитров ледяной MGM. Затем поместите форму для промывки на лед на две минуты, чтобы ослабить взаимодействие клеток и субстрата, и убедитесь, что чашка плоская, чтобы предотвратить высыхание участков формы для промывки. После этого энергично пипетируйте пипеткой объемом 10 миллилитров и контроллером пипетки на высокой скорости, чтобы извлечь клетки из проволочной чашки.

Нарисуйте сетку 16 на 16 струей жидкости из пипетки, чтобы попытаться удалить все клетки. Важно найти баланс между общим восстановлением клеток и здоровьем вашей культуры. Повторное пипетирование надосадочной жидкости клеточной жидкости на проволочной чашке приведет к снижению жизнеспособности вашей культуры.

Проверьте клетки под микроскопом при 20-кратном увеличении, чтобы убедиться, что они оторвались от пластины. Отметьте места в верхней части чашки, где застряли клетки, и повторите пипетирование в этих местах. Соберите клеточную суспензию и выделите три-четыре миллилитра надосадочной жидкости в каждую 15-миллилитровую коническую трубку.

Вращайте его в течение 15 минут при 500 x g при четырех градусах Цельсия с медленным торможением. Через 15 минут отсадите надосадочную жидкость, оставив 0,5 миллилитра MGM с клеточной гранулой. Затем повторно суспендируйте каждую гранулу в оставшейся MGM и вытащите ячейки из всех пробирок.

После этого подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Теперь нанесите 15 микролитров коллагенового покрытия IV прямо в центр 24-луночного анионного катионного покрытия планшета для культуры тканей и инкубируйте в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После подсчета клеток гемоцитометром разбавьте их до 2,3 х 10 до пяти на миллилитр в MGM.

Аспирируйте коллаген внутривенно и немедленно нанесите 15 микролитров клеточной суспензии в эту точку, чтобы получить 3,5 x 10 на три клетки в каждой точке. Затем инкубируйте в течение пяти-десяти минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы клетки прилипли. Затем аккуратно добавьте в лунку 500 микролитров уравновешенного ТИЦ CO2.

Если покрытие на покровных стеклах неровное, сначала покройте стерильное стекло защитным стеклом 10 микрограммами на миллилитр PDL в воде в течение одного часа при комнатной температуре. Затем трижды промойте их водой и дайте им высохнуть в капюшоне под ультрафиолетовым светом, прежде чем приступить к точечному нанесению покрытия на чехлы. Чтобы продемонстрировать успешное выделение и культивирование высокочистой микроглии, мы выделили микроглию у крыс P21 и культивировали эти клетки в TIC или TIC с добавлением 10% FCS в течение восьми дней.

Затем клетки фиксировали и окрашивали микроглиальными маркерами и маркерами пролиферации. Клетки, культивируемые в TIC, демонстрируют разветвленную морфологию, низкий уровень пролиферации и экспрессию маркеров микроглии. Для сравнения, клетки, культивируемые в TIC с добавлением 10% FCS, также окрашены на маркеры микроглии, но демонстрируют высокий уровень пролиферации и амебоидной морфологии, свойства, часто наблюдаемые у активированной микроглии.

В дополнение к окрашиванию на клеточные маркеры, RNA-Seq на свежевыделенных клетках может стать мощным и чувствительным инструментом для оценки профиля РНК клеток и может помочь определить исходную чистоту культур. Микропанорамирование CD11b обычно приводит к небольшому проценту CD11b-положительных нейтрофилов и переносу моноцитов, в дополнение к CD11b-положительной микроглии. Эти клетки умрут при TIC через несколько дней, но могут усложнить анализ более ранних временных точек.

Вот покадровое видео микроглии крысы P21 после 14 DIV в TIC. Через две недели культуры, не содержащие сыворотки, демонстрируют динамическое поведение наблюдения с быстрым расширением процесса и втягиванием по всей чашке. Вот покадровый фильм микроглии крысы P21 после пяти DIV в TIC до и после воздействия сыворотки теленка плода.

Быстрые морфологические изменения заметны после воздействия сыворотки крови. После освоения этого протокола его можно выполнить за четыре-пять часов, если он выполнен правильно. После этой процедуры могут быть проведены другие анализы для мониторинга фагоцитоза, хемотаксиса, выживаемости, высвобождения цитокинов, транскрипционных реакций на стимулы, чтобы ответить на дополнительные вопросы о функции микроглии.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как быстро изолировать микроглию из тканей взрослого грызуна и культивировать их в условиях, не содержащих сыворотку.