Роман пассивной очистки методы для быстрого производства оптической прозрачности в целом тканях ЦНС
8 мая 2018 г.
Здесь мы представляем два новых методологий, psPACT и ударным, для достижения максимальной оптической прозрачности и последующего анализа микроскопических сосудистую ткани в нетронутыми грызун весь ЦНС.
Общей целью этих методов psPACT и mPACT является быстрое очищение всей ткани ЦНС без необходимости использования системы электрофоретического очищения ткани. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области моделирования заболеваний человека, такие как болезнь Альцгеймера или травма, а также дегенерация и онкогенез. Основное преимущество этой методики заключается в том, что ткань ЦНС мыши не повреждается при электрофоретической очистке ткани, а быстро очищается за счет модифицированной пассивной очистки.
Впервые идея этого метода пришла нам в голову после использования оригинального PACT и прошлого метода для очищения мозга. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку методы psPACT и mPACT сложны в использовании, поскольку этот метод имеет несколько этапов подготовки образцов. Начните с приготовления раствора коктейля PACT, добавив порошок VA-044 в раствор 4% PFA и 4% акриламида в конечной концентрации 0,25%. После перфузии тканей раствором PACT полностью погрузите весь головной и спинной мозг в 50-миллилитровую трубку, содержащую охлажденный раствор PACT, и храните при температуре четыре градуса Цельсия в течение 24 часов.
Через 24 часа перенесите ткань в 50-миллилитровую пробирку, содержащую свежий холодный раствор PACT, и подсоедините колпачок пробирки к системе гибридизации тканевого геля, подключенной к резервуару с азотом и установленной на 37 градусов Цельсия. Затем включите вакуум и газ на 10 минут, чтобы погрузить образец в газообразный азот. Чтобы полимеризовать гидрогель, поместите пробирку с образцом в встряхивающий инкубатор, установленный на 150 об/мин и 37 градусов Цельсия, на три часа или до завершения полимеризации.
После инкубации используйте промокательную бумагу, чтобы удалить остатки полимеризованного гидрогеля, окружающего ткани. Затем перенесите ткань в 50-миллилитровую пробирку, содержащую очищающий раствор. Поместите образец в встряхивающий инкубатор, установленный на 37 градусов Цельсия и 150 оборотов в минуту, пока ткань не будет очищена.
В среднем, для достижения полной четкости в ЦНС мыши требуется около 20 дней. Начните psPACT с ЦНС с мыши, перфузированной 4% PFA, которая была зафиксирована в 4% PFA при четырех градусах Цельсия в течение 24 часов. Промойте неподвижную ткань в течение одного часа в 0,1 моляра PBS.
После промывки переложите ткань в раствор A4P0, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. На следующий день, после промывания ткани в PBS в течение пяти минут, погрузите ткань в 0,25% VA-044 в PBS и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести-24 часов. Отделение акриламида от последующей стадии VA-044 позволяет избежать необходимости удаления оставшихся неполимеризованных гидрогелевых мономеров, окружающих ткань, которые могут нарушить окончательную целостность ткани после достижения прозрачности с помощью PACT.
После инкубации переложите ткани в свежий холодный раствор ВА-044. Затем погрузите образец в газообразный азот на 10 минут. Переведите ткань в очищающий раствор.
Затем инкубируйте образец в встряхивающем инкубаторе, настроенном на 37 градусов Цельсия и 150 об/мин, пока ткань не будет очищена. В среднем, для достижения полной четкости ЦНС мыши требуется примерно 17 дней. Для mPACT следуйте протоколу psPACT до этапа решения по очистке.
Затем полностью погрузите раствор для очищения тканей, содержащий 0,5% альфа-тиоглицерин, агент, не вызывающий потемнение, в дополнение к 8% SDS в 0,1 молярного PBS. Поместите образец в встряхивающий инкубатор, установленный на 37 градусов Цельсия и 150 оборотов в минуту, пока ткань не будет очищена. В среднем, ЦНС мыши требуется всего две недели, чтобы достичь полной прозрачности при использовании mPACT.
В настоящем исследовании образцы мозга мышей, обработанные по протоколу mPACT, достигли оптической прозрачности через 14 дней, опередив образцы, обработанные по протоколам PACT и psPACT. Образцы цельной ЦНС крысы, очищенные mPACT, достигли максимального клиренса за 20 дней. Мозг взрослой крысы, в отличие от всей ЦНС, был очищен с помощью mPACT всего за пять дней.
После того, как эта техника будет освоена, ее можно будет проделать за две недели с помощью всей ЦНС мыши, если она будет выполнена правильно. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии и анатомии к изучению патофизиологических заболеваний, таких как повреждение тканей, пороки развития, рак и нейродегенеративные заболевания в моделях ЦНС млекопитающих.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлены две инновационные методики, psPACT и mPACT, предназначенные для повышения оптической прозрачности и облегчения микроскопического анализа интактных сосудов центральной нервной системы (ЦНС) грызунов. Эти методы направлены на быстрое просветление всей ткани ЦНС без ее повреждения, что позволяет решать ключевые вопросы, связанные с моделями заболеваний человека, такими как болезнь Альцгеймера и туморогенез.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Методы просветления тканей
- Микроскопическая визуализация
Теоретические сведения
- Исследование основывается на предыдущих методах, подчеркивая ограничения электрофоретического просветления тканей.
- Акцентируется необходимость в быстрых и эффективных процессах просветления тканей ЦНС грызунов.
- Предлагаются решения как для фундаментальных исследований, так и для клинического применения в нейробиологии.
Цель исследования
- Разработать и валидировать psPACT и mPACT как эффективные протоколы просветления тканей ЦНС.
- Расширить возможности исследователей, изучающих нейропатологические состояния.
- Обеспечить более качественную визуализацию сосудистой сети тканей ЦНС.
Используемые методы
- Методы включают многоэтапный протокол подготовки и просветления тканей ЦНС с использованием растворов PACT.
- Основные биологические модели включают образцы ЦНС мышей и крыс, с основной целью достижения оптической прозрачности.
- Для достижения полной прозрачности при использовании psPACT обычно требуется около 20 дней, в то время как mPACT позволяет добиться этого примерно за 14 дней.
- Для процессов полимеризации и просветления применяются специализированные растворы и условия инкубации.
Основные результаты
- mPACT обеспечивает значительное сокращение времени просветления тканей по сравнению с традиционными методами.
- Образцы, обработанные с помощью mPACT, продемонстрировали оптическую прозрачность за более короткий промежуток времени, что указывает на повышенную эффективность для исследовательских целей.
- Данные методы оказываются эффективными для облегчения изучения различных неврологических состояний.
Выводы
- Данное исследование позволяет осуществлять быстрое и эффективное просветление тканей ЦНС, расширяя исследовательские возможности в области нейробиологии.
- Разработанные новые методологии служат ценными инструментами для изучения механизмов заболеваний и повреждений тканей.
- Результаты имеют большое значение для понимания нейродегенеративных заболеваний и совершенствования патологоанатомических исследований за счет применения улучшенных методов визуализации.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Новые методы пассивного просветления, такие как psPACT и mPACT, устраняют критическую проблему в нейробиологических исследованиях и разработках, обеспечивая быструю и высокоточную оптическую прозрачность всей ткани ЦНС без электрофоретического повреждения. Эта возможность способствует валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов в моделях нейродегенеративных заболеваний за счет сохранения субклеточной архитектуры при одновременном сокращении сроков визуализации. Данные методы повышают прогностическую достоверность доклинических исследований болезни Альцгеймера, туморогенеза и моделей повреждений благодаря улучшенной визуализации нейропатологических фенотипов.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы на моделях неповрежденной ЦНС за счет сохранения субклеточных структур и клеточных сетей для исследований взаимодействия с мишенью.
- Операционная ценность: снижает количество артефактов обработки тканей, связанных с электрофоретическим просветлением, что повышает воспроизводимость результатов фенотипического скрининга.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов, обеспечивая более четкие показатели прогрессирования нейродегенерации в соответствующих моделях заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать стандартизированные, прозрачные препараты ЦНС, подходящие для визуализации субклеточных биомаркеров и модуляции путей с высоким разрешением.
- Практическая ценность: устраняет необходимость в специализированном электрофоретическом оборудовании, снижая барьеры для внедрения анализа в исследовательских группах.
- Масштабируемость: mPACT обеспечивает прозрачность ЦНС мыши примерно за 14 дней, что позволяет точно планировать сроки проведения кампаний по скринингу соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: способствует плавному переходу от этапа поиска к доклинической валидации за счет сохранения целостности тканей для лонгитюдных исследований туморогенеза и пороков развития.
- Снижение механистических рисков: позволяет визуализировать субклеточные структуры в патологических тканях, что уменьшает неоднозначность при интерпретации механизмов воздействия на мишень.
- Достоверность модели заболевания: обеспечивает стабильное просветление ЦНС у различных видов грызунов (мыши/крысы), что повышает сопоставимость результатов разных исследований в рамках фармакологии безопасности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
psPACT и mPACT вписываются в континуум от ранних этапов поиска до доклинических исследований, в частности поддерживая валидацию мишеней и оптимизацию соединений-лидеров путем предоставления количественно оцениваемых моделей ЦНС, пригодных для визуализации.
- Биологические исследования: позволяют проверять гипотезы с помощью 3D-картирования экспрессии белков и распределения клеток в неповрежденной ткани, что проясняет роль определенных путей в моделях заболеваний.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых количественных препаратов тканей для стандартизированной оценки воздействия соединений на архитектуру ЦНС.
- Аналитика: позволяет получать изображения высокого разрешения, которые дают возможность сравнивать структурные изменения при различных условиях лечения с улучшенным соотношением сигнал/шум.
- Трансляционные исследования: обеспечивают протеомную и структурную преемственность от этапа открытия до доклинических стадий, поддерживая согласованность биомаркеров в моделях нейродегенерации и повреждений.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для просветления тканей ЦНС, применимую в нескольких проектах по изучению нейропатологии, что сокращает затраты на повторную разработку методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности благодаря визуализации целостной ткани.
- Операционная ценность: повышает уровень стандартизации и воспроизводимости, позволяя избежать влияния переменных параметров электрофореза и зависимости от оборудования.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет ускорения получения доклинических данных для кандидатов, нацеленных на ЦНС.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию программ по нейродегенерации и онкологии с учетом рисков благодаря более быстрым и четким фенотипическим результатам.
Особенности реализации
- Требуется опыт в гистологии тканей, химии гидрогелей и выполнении протоколов инкубации для проведения многоэтапной подготовки образцов.
- Процесс зависит от наличия встряхивающих инкубаторов, систем подачи азота и сред с контролируемой температурой для фаз полимеризации и просветления гидрогеля.
- Необходима межкомандная стандартизация приготовления растворов (например, концентраций VA-044 и SDS) и контроля времени для обеспечения воспроизводимости результатов между лабораториями.
- Адаптация метода для тканей, не относящихся к ЦНС (например, почек, селезенки), требует валидации времени просветления и сохранения структуры, как указано в исходных материалах.
- Практическое ограничение: успех протокола зависит от тщательного выполнения всех действий из-за многоэтапности подготовки; любые отклонения могут привести к неполному просветлению или повреждению тканей.
