Боковой гемисекции спинного мозга и асимметричные поведенческие оценки у взрослых крыс
24 марта 2020 г.
Здесь мы описываем хирургические процедуры для получения надежного бокового гемисекции спинного мозга (HX) на9-м грудном уровне у взрослых крыс и нейроповеденческих оценок, предназначенных для обнаружения асимметричного дефицита после такой односторонней травмы.
Этот протокол обеспечивает надежную модель животного спинного мозга боковой гемизекции, которая имитирует синдром Брауна-Секварда у людей, и новую комбинированную шкалу поведения для оценки асимметричного дефицита поведения. Эта модель hemisection мыши может более далее наше вникание неврологических нарушений которые происходят в синдроме Brown-Sequard в людях. В отличие от ваших упомянутых оценок, наша новая комбинированная шкала поведения может быть применена к любой форме, которая требует оценки асимметричной, локомотивной и лабораторной дефицита.
Использование этой, последовательной, естественной модели геми-раздела может облегчить сравнение экспериментального результата между фундаментальными и переводческих исследований. Использование последовательного результата с этой моделью может быть трудным для начинающих. Критическим шагом является размещение иглы вертикально в средней линии, в качестве руководства для индуцирования травмы.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как выполнять как хирургические и поведенческие процедуры. В день процедуры очистите хирургический стол 70%-ным этанолом и поместите на стол предварительно разогретую грелку. После покрытия хирургической области с стерильной хирургической драпировки, подтвердить отсутствие реакции на щипец-щепотку в анестезированной крысы.
Нанесите мазь на глаза животного, чтобы предотвратить высыхание роговицы, и побрить волосы, перелив грудные позвонки. Затем очистите обимению кожи тремя чередующимися скрабами на основе йода и этанола. Когда животное будет готово, найдите тринадцатое ребро и следуйте за ребром, чтобы определить его связь с позвонком Т-13.
Подсчитайте, чтобы определить T-9 позвонка, и использовать число пятнадцать скальпель лезвие, чтобы сделать три-четыре сантиметра средней линии кожи разрез в течение восьми до одиннадцатого позвонков спинных процессов. Переместите крысу под хирургическим микроскопом, и прямо вскрыть и отделить параспинаальные мышцы боковой от спинных процессов к граням Т-9 и Т-10 позвонков с обеих сторон. Disablise позвоночника с измененным стабилизирующим держателем, сделать щель по обе стороны боковой кости позвонка, и слайд нержавеющей стали руки держателя под подвергаются поперечных аспектов процесса.
Затяните винты, чтобы обеспечить держатель, и использовать protractor подвергать T-8 до 11 позвонков laminae и спинных процессов. Используя rongeur, отрезать T-9 спинной процесс, и удалить небольшую часть ламины, слева от средней линии и всей правой части ламины, как можно зже. Затем вставьте ronguer осторожно под ламина, и резать один маленький кусочек кости в то время, пока желаемая область ламинэктомии завершена.
Далее, определить спинной средней линии спинного аккорда, и вставить 30-го калибра иглы вертикально через середину, в спинномозговой аккорд, вся путь к брюшной стенке позвоночного канала, с скошенной лицом вправо. Остановить кровотечение с небольшим куском стерильной пены гель, и вставить один кончик пары iridectomy микрохирургии ножницы через середину иглы трек, а другой кончик вдоль боковой поверхности правого hemichord, чтобы сделать полный разрез на правом hemichord. Используйте боковой край той же иглы, как нож, чтобы прорезать разрыв поражения, чтобы подтвердить полную правую подмигивание.
И визуализировать дно позвоночного канала, чтобы проверить полноту правильной гемизекции. Используйте цементную смесь для строительства узкого моста над губкой, а также спинных процессов Т-8 и Т-10. Затем, шов мышцы и слои кожи отдельно с 4/0 шелковой нити, и вводить 0,9% стерильных солевой подкожно для поддержания гидратации.
Нажатие мочевого пузыря два-три раза в день в течение первой недели, и один-два раза в течение следующих недель, пока спонтанное нарушение мочевого пузыря возвращается. В соответствующее экспериментальное время указывает после процедуры, поместите взрослую крысу в открытое поле эксперимента, и изучить движение животного в течение четырех минут. Используя таблицу, назначьте значение 1 для yes'and 0 для no'for каждой категории поведения, и суммировать общую стоимость, чтобы дать окончательный односторонний балл шага hemisection 0-8.
Для анализа соединения ворот завехайте экспериментальное животное, гуляющее по узкому устройству взлетно-посадочной полосы, и назначьте оценку 0 для no'1 для regular'and/or clumsy'and 2 для normal'for каждой категории соединения. Для оценки контактного размещения удерживайте животное в вертикальном положении, чтобы обе задние конечности были доступны для ответа на размещение, и чистите спинную поверхность одной задней конечности слегка вперед к краю поверхности. Наблюдайте размещение ноги на поверхность, и назначьте контакт задней конечности помещая счет 0 для никакого placement'and 1 для placement'For grid-walking оценки, поместите крысу на повышенном тридцать шесть на тридцать восемь сантиметров пластиковой сетки сетки проволочной сетки с 3 см в квадрате отверстия, и видеозапись крысы ходить свободно через платформу в течение 30 шагов, чтобы позволить количественное определение числа ног промахов для каждого
Амино флуоресцентное окрашивание поперечного сечения в эпицентре травмы показывает полную потерю правого гемикхорда. И сохранение левой гемихорд контралатеральной травмы. Оценки индивидуальных показателей оценки ворот могут быть проанализированы отдельно, или они могут быть объединены в составное комбинированное поведение после оценки гемизекции.
В первые три дня после травмы, крысы теряют способность к шагу, с шагом, как движения начинают появляться на ipsilesional стороны на 7 10 дней после травмы. И с большинством шагов спинной шаги. Через 28 дней после hemisection Т-9, крысы могут принимать подошвеные шаги с практически нормальной координации.
Для сравнения, противная задняя конечность меньше прерывается с односторонним оценка подлготовки снижается в течение первых пяти дней после травмы, и возвращение к исходной линии на 10 день, после травмы. Для общего теста соединения ворот, как стабильность и адаптивность координации после подмиговорки, заметно снижается в течение первых пяти дней после травмы. Контактное размещение и сетка ходьба из ипсилатеральной задней конечности также страдают, как правило, восстанавливается, когда животное начинает принимать подошвевые шаги.
Это может быть трудно производить чистый вырезать травмы. Размещение иглы в середине может быть полезным ориентиром для страхования полного разделения ткани.
Обзор
В данной статье подробно описываются хирургические процедуры для создания надежной латеральной гемисекции спинного мозга на уровне 9-го грудного сегмента у взрослых крыс. Также представлены методы нейроповеденческой оценки для выявления асимметричного дефицита после одностороннего повреждения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Поведенческая оценка
- Животные модели
Теоретические сведения
- Модель латеральной гемисекции спинного мозга имитирует синдром Броун-Секара.
- Понимание неврологических нарушений в данной модели может дать ценную информацию о соответствующих состояниях у людей.
- Для оценки дефицитов представлена новая комбинированная шкала поведения.
- Начинающим исследователям может быть сложно добиться стабильных результатов.
Цель исследования
- Создать надежную модель повреждения спинного мозга на животных.
- Разработать поведенческую шкалу для оценки локомоторного дефицита.
- Облегчить сопоставление результатов фундаментальных и трансляционных исследований.
Используемые методы
- Хирургические процедуры по индуцированию гемисекции у взрослых крыс.
- Поведенческие тесты, включая тест «открытое поле» и оценку походки по решетке.
- Системы оценки локомоции и реакций при постановке конечности.
- Гистологический анализ для подтверждения полноты повреждения.
Основные результаты
- У крыс наблюдается первоначальная утрата способности к ходьбе после травмы.
- Шагоподобные движения на ипсилатеральной стороне восстанавливаются через 7–10 дней.
- Функция контралатеральной задней конечности возвращается к исходному уровню к 10-му дню.
- Поведенческие показатели свидетельствуют о значительном восстановлении к 28-му дню после травмы.
Выводы
- Данная модель позволяет изучить особенности восстановления после повреждения спинного мозга.
- Поведенческие тесты позволяют эффективно оценить степень восстановления и имеющийся дефицит функций.
- Это исследование углубляет понимание синдрома Броун-Секара у людей.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол описывает создание надежной модели латеральной гемисекции спинного мозга у крыс, которая имитирует синдром Броун-Секара у людей, что позволяет снизить механистические риски при разработке терапевтических кандидатов, направленных на устранение асимметричного сенсомоторного дефицита. Комбинированная шкала поведения (CBS-HX) обеспечивает количественную одностороннюю оценку функций задних конечностей, что способствует валидации мишеней и повышению прогностической достоверности в рамках доклинических исследований. Облегчая кросс-функциональное сравнение паттернов восстановления ипсилатеральной и контрлатеральной сторон, эта модель помогает в приоритизации портфеля препаратов и принятии обоснованных решений о продвижении нейропротекторных или нейровосстановительных методов терапии с учетом рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся односторонней модуляции сенсомоторных путей и специфических для данных путей механизмов восстановления.
- Операционная ценность: предоставляет стандартизированную хирургическую и поведенческую базу для согласованной оценки воздействия на мишень в рамках различных исследовательских кампаний.
- Прогностическая ценность: способствует биологическому снижению рисков за счет разделения ипсилатерального и контралатерального функционального вкладов, что уменьшает механистическую неоднозначность при идентификации перспективных соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: CBS-HX позволяет получать количественные суммарные баллы (0–18) на основе одностороннего шага задней конечности, сопряжения движений, постановки лапы и ходьбы по сетке, что обеспечивает высокую пропускную способность функционального скрининга.
- Воспроизводимость: Стандартизированные критерии оценки (например, присвоение 0/1 для шага, 0–2 для сопряжения) обеспечивают надежность межэкспертной оценки и стандартизацию анализа в разных лабораториях.
- Масштабируемость: Платформы для тестов в открытом поле и ходьбы по сетке поддерживают повторные лонгитюдные оценки, что облегчает анализ зависимости «доза-эффект» и временной динамики в каскадах скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболевания: Модель воспроизводит ключевые особенности синдрома Броуна-Секара у людей, включая ипсилатеральную потерю двигательных функций и контралатеральный дефицит болевой и температурной чувствительности, что улучшает согласованность трансляционных биомаркеров.
- Преклиническая преемственность: Обеспечивает возможность лонгитюдного отслеживания восстановления (например, возвращение плантарного шага к 28-му дню) для принятия обоснованных решений о переходе к следующим этапам доклинической разработки с учетом рисков.
- Снижение механистических рисков: Позволяет проводить раздельный анализ ответов ипсилатеральной и контралатеральной задних конечностей, что помогает разграничить специфические эффекты воздействия на мишень и системную компенсацию.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс разработки — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, обеспечивая принятие решений о целесообразности дальнейшего развития проекта на основе показателей асимметричного функционального восстановления.
- Открывающая биология (Discovery Biology): Обеспечивает проверку гипотез об односторонней модуляции путей и снижение биологических рисков посредством отслеживания нарушений функций ипсилатеральной задней конечности.
- Скрининг: Предоставляет готовые к анализу количественные данные (например, суббаллы CBS-HX) для надежной оценки соединений в тестах двигательной функции.
- Аналитика: Позволяет формировать лонгитюдные наборы поведенческих данных (например, баллы за шаг в течение 28 дней), что обеспечивает статистическое сравнение эффектов терапии в различных экспериментальных группах.
- Трансляционные исследования: Моделирует патофизиологию гемисекции у человека, способствуя согласованию биомаркеров и преемственности между доклиническим и клиническим этапами разработки стратегий сенсомоторного восстановления.
- Корпоративное повторное использование: Хирургический и поведенческий протоколы адаптируемы к другим моделям неполного повреждения спинного мозга и различным уровням позвонков, что способствует повторному использованию платформы в рамках портфелей открытий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую достоверность валидации мишени за счет изоляции одностороннего неврологического дефицита и отслеживания паттернов временного восстановления.
- Операционная ценность: гарантирует воспроизводимость благодаря стандартизированным хирургическим ориентирам (например, идентификация позвонка T9 путем подсчета ребер) и слепому методу оценки поведения.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя принимать ранние решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе профилей асимметричного моторного восстановления, что снижает биологические риски на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: способствует приоритезации кандидатов с учетом рисков при демонстрации дозозависимого улучшения показателей CBS-HX, особенно на ипсилатеральной стороне поражения.
Особенности реализации
- Требуются навыки микрохирургии на грызунах, знание анатомии спинного мозга и владение методами стерильной техники для обеспечения полноты поражения и благополучия животных.
- Зависимость от микрохирургического инструментария (например, операционного микроскопа, кусачек, иглы 30-го калибра) и инфраструктуры послеоперационного ухода (например, грелок, протоколов опорожнения мочевого пузыря).
- Необходима межгрупповая стандартизация между специалистами по хирургии, поведению и гистологии для обеспечения согласованности при верификации и оценке степени поражения.
- Адаптация к другим моделям (например, к гемисекции в шейном или поясничном отделах) требует корректировки анатомических ориентиров позвоночника и чувствительности поведенческих тестов к регионарным двигательным функциям.
- Практические ограничения включают техническую вариабельность полноты поражения, которую можно минимизировать с помощью гистологической валидации (например, аминофлуоресцентного окрашивания) и критериев исключения по результатам поведенческих тестов.
